本发明专利技术提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HNPJ/2017，属于病毒疫苗技术领域，所述病毒毒株PEDV CH/HNPJ/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16216。本发明专利技术提供了包括所述病毒毒株基因组的重组载体以及所述重组载体的构建方法。本发明专利技术所述病毒毒株位于G2b亚群，与中国疫苗经典毒株CV777分属于不同的群，与AJ1102和CHGD‑01毒株亲缘关系较近，亲缘关系更接近2010年后爆发的猪流行性腹泻疫情中分离获得的猪流行性腹泻病毒毒株，与现有流行毒株存在的基因型差异较小，可应用于制备猪流行性腹泻疫苗，免疫效果好。
【技术实现步骤摘要】
一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用
本专利技术属于病毒疫苗
，尤其涉及一株猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性的猪肠道传染病。PEDV可以感染各年龄段的猪，但哺乳仔猪更易感染，其死亡率和发病率接近100％。1971年该病首次在英国被发现，随后蔓延至欧洲及亚洲部分国家。2013年美国首次报道了PEDV感染，而后该病迅速蔓延至全美，造成了严重经济损失，从而使得PEDV受到世界各国的关注。我国2010年就曾爆发过严重的PED疫情。近年来，PED的流行更是越来越广泛，新的变异株不断出现，商品化疫苗与流行毒株的抗原性不匹配，免疫效果不佳，从而严重影响着我国养猪业的健康发展。目前市售猪流行性腹泻疫苗几乎全部使用的是经典毒株，与流行毒株存在基因型差异，进而导致疫苗免疫效果较差。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一株新的、有效候选疫苗猪流行性腹泻病毒毒株及其在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017，所述病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16216。本专利技术还提供了一种包括上述病毒毒株基因组的重组载体。本专利技术提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)从上述的病毒毒株中提取获得RNA；2)反转录所述RNA获得cDNA，3)扩增所述cDNA获得PEDV全基因组DNA；4)将所述PEDV全基因组DNA与载体连接获得重组载体。优选的，步骤2)中所述反转录的温度为40～44℃，所述反转录的时间为55～65min。优选的，步骤2)中所述反转录的体系包括以下组分：所述反转录引物的浓度为10μM，所述反转录引物为PEDV-21438R，具体的核苷酸序列为TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT。优选的，步骤3)中扩增所述cDNA的体系包括以下组分：所述正向引物和反向引物的浓度为为10μM。优选的，步骤3)中扩增所述cDNA的程序包括：优选的，所述正向引物为PEDV-20320F，具体序列为AACACGTCATCGTCAGAGGC；所述反向引物为PEDV-21438R，具体核苷酸序列为TACCATGCACCAAAGTGGAATCAT。本专利技术还提供了所述猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本专利技术还提供了所述重组载体在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017在转染细胞的第一代，细胞就表现出显著的细胞病变，说明本专利技术提供的病毒毒株毒力较强；经遗传进化分析，所述病毒毒株位于G2b亚群，与中国疫苗经典毒株CV777分属于不同的群，与AJ1102和CHGD-01毒株亲缘关系较近，亲缘关系更接近2010年后爆发的猪流行性腹泻疫情中分离获得的猪流行性腹泻病毒毒株，与现有流行毒株存在的基因型差异较小，可应用于制备猪流行性腹泻疫苗，免疫效果好。附图说明图1为PEDVCH/HNPJ/2017毒株P70代细胞病变图；图2为PEDVCH/HNPJ/2017毒株全基因组序列扩增电泳图；图3为PEDVCH/HNPJ/2017毒株系统进化树图谱；图4为PEDVCH/HNPJ/2017毒株S基因序列比对；图5为PEDVCH/HNPJ/2017毒株的生长曲线；图6为PEDVCH/HNPJ/2017毒株各代次TCID50值；图7为PEDVCH/HNPJ/2017毒株IFA鉴定；图8为电子显微镜观察PEDVCH/HNPJ/2017病毒粒子形态；图9为PEDVCH/HNPJ/2017毒株致病性分析；图10为感染PEDVCH/HNPJ/2017病毒仔猪肠道病理变化。生物保藏说明本专利技术提供的猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017于2018年08月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo.16216。具体实施方式本专利技术提供了一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017，所述病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16216。本专利技术中所述病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017来源于中国湖南省平江PEDV阳性毒株的样品，本专利技术中分离和培养所述病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017的细胞优选为Vero细胞。本专利技术中，传代培养所述Vero细胞的培养基优选为DMEM培养基，所述DMEM培养基中优选的还包括体积百分含量为10％的FBS和体积百分含量为1％双抗的。本专利技术中所述病毒毒株的培养方法包括以下步骤：将所述PEDV阳性毒株的样品和胰酶加入含1％双抗，不含FBS的DMEM培养基中震荡混匀获得混合液；然后将生长状态良好的单层Vero细胞加入混合液后置于含有5％CO2的37℃温箱孵育；孵育结束后加入新鲜的含1％双抗，不含FBS的DMEM培养基培养，当细胞病变大于90％，收集病毒液。在本专利技术中，所述PEDV阳性毒株的样品与DMEM培养基的体积比优选为1：(4～6)，更优选为1:5。在本专利技术中，所述混合液中胰酶的浓度优选为15～25μg/ml，更优选为20μg/ml。本专利技术中所述孵育的时间优选为50～70min，更优选为60min，所述孵育过程中，优选的每20min摇匀一次。本专利技术中所述孵育结束后加入新鲜DMEM培养基的体积优选为初始DMEM培养基体积的1.8～2.2倍，更优选为2倍。本专利技术还提供了一种包括上述病毒毒株基因组的重组载体。所述重组载体包括上述病毒毒株基因组，转染到细胞中，具有上述病毒毒株的毒力。本专利技术提供了所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)从上述的病毒毒株中提取获得RNA；2)反转录所述RNA获得cDNA，3)扩增所述cDNA获得PEDV全基因组DNA；4)将所述PEDV全基因组DNA与载体连接获得重组载体。本专利技术首先从上述的病毒毒株中提取获得RNA；本专利技术对所述RNA提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的病毒RNA提取方法即可。在本专利技术具体实施过程中，所述RNA提取优选的采用ViralRNAMiniKit(Qiagen,Germany)RNA提取试剂盒。本专利技术在获得所述RNA后，反转录所述RNA获得cDNA。在本专利技术中，所述反转录的温度优选为40～44℃，更优选为42℃，所述反转录的时间优选为55～65min，更优选为60min。在本专利技术中，所述反转录的体系优选的包括以下组分：5×AMVRTBuffer5μL；10mMdNTP3μL；PEDV-21438R(10μM)2μL；AMV反转录酶0.5μL；RNA酶抑制剂0.5μL；DEPC水7μL；RNA模板7μL。本专利技术在所述反转录结束后，扩增所述cDNA获得PEDV全本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDV CH/HNPJ/2017，其特征在于，所述病毒毒株PEDV CH/HNPJ/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16216。
【技术特征摘要】
1.一株猪流行性腹泻病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017，其特征在于，所述病毒毒株PEDVCH/HNPJ/2017保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.16216。2.一种包括权利要求1所述病毒毒株基因组的重组载体。3.权利要求2所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)从权利要求1所述的病毒毒株中提取获得RNA；2)反转录所述RNA获得cDNA，3)扩增所述cDNA获得PEDV全基因组DNA；4)将所述PEDV全基因组DNA与载体连接获得重组载体。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述反转录的温度为40～44℃，所述反转录的时间为55～65min。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述反转录的体系包括以下组分：所述反转录引物的浓度为10μM，所述反转录引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘新生，王永录，方玉珍，周鹏，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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