先天性免疫系统重构的BHK21细胞群及其细胞克隆增毒应用技术方案

本发明专利技术公开了一种增强病毒增殖的方法，并构建了先天性免疫系统重构的BHK21细胞群，用于增殖病毒。本发明专利技术公开的方法为病毒增殖打开了新思路，扩大了BHK21细胞的应用范围，为能够防治病毒的疫苗的研制打下了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
先天性免疫系统重构的BHK21细胞群及其细胞克隆增毒应用
本专利技术属于生物技术及兽用生物制品工程
，更具体涉及一种随机敲除先天性免疫系统效应蛋白分子的BHK21细胞群及其细胞克隆增殖病毒的应用。
技术介绍
BHK21细胞是目前畜禽疫苗病毒增殖的常用宿主细胞，各大研究机构以及兽用疫苗生产企业都在进行该细胞增殖各种病毒的种细胞筛选、细胞悬浮培养、病毒增殖工艺等研究，是目前的研究热点。宿主细胞的先天性免疫系统是产生于系统发育的早期和出现在宿主抗感染应答的初始阶段，执行免疫功能的机体防御机制，它起到了抗感染，清除体内有害成分，自身免疫以及移植排斥的功能。宿主细胞通过其病原相关模式识别受体感知病原体的入侵，进而启动干扰素和一系列的细胞因子抵抗病原的入侵。这些模式分子在不同类型的细胞中或不同的细胞器区域内表达，如细胞膜、内涵体膜、溶酶体膜、细胞质等等，主要负责监测病原体的各种成分分子，以启动炎症反应和抗病毒免疫。具体的模式分子包括Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体、DAI分子、AIM2分子等等。对于病毒的规模化增殖而言，降低先天性免疫系统的信号传导通路，抑制病毒增殖拮抗作用有利于病毒的高效扩增。利用基因组编辑技术对BHK21细胞先天性免疫系统中各信号分子进行随机组合敲除，减少因外源病毒感染造成的先天性免疫应答，为多种病毒在BHK21细胞中高滴度增殖提供良好的胞内生物环境。现有技术中常利用CRISPR/Cas9系统靶向病毒基因组DNA有效抑制病毒感染。根据CRISPR/Cas9技术原理，设计靶向PRV保守的UL30基因的gRNA，并成功构建能够稳定表达sgRNA和Cas9核酸内切酶的PK-15细胞系。结果显示，用PRV感染该细胞后，CRISPR/Cas9系统对PRVUL30基因的编辑作用可以导致UL30基因的碱基缺失或者插入，且能够显著抑制PRV在细胞中的增殖。ERp57是细胞内质网内的蛋白二硫键异构酶家族成员，可以催化蛋白二硫键的合成以促进蛋白折叠。为研究erp57基因敲除对流感病毒复制的影响，有研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了erp57基因的向导RNA(gRNA)敲除质粒pGEM-erp57gRNA，并将其与pCas9-EGFP共转染至人肺腺癌细胞A549中，采用流式分选及限制性稀释的方法筛选单细胞克隆株，通过靶基因组测序及westernblot检测，筛选获得了erp57基因敲除的A549细胞系。erp57基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。此外，将H1N1亚型流感病毒分别感染野生型和erp57基因敲除细胞系以测定erp57基因敲除对流感病毒复制水平的影响。结果显示流感病毒在erp57基因敲除细胞中的复制显著地受到了抑制。纵观现有技术，可以发现，本领域技术人员多用基因敲除的方法抑制病毒的增殖，专利技术人未曾发现先天性免疫系统重构的BHK21细胞群及其细胞克隆在病毒增殖方面的应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征在于，所述病毒在进行了先天性免疫系统重构的BHK21细胞中进行增殖。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，BHK21细胞中的先天性免疫系统中的信号传导通路被降低。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述信号传导通路的降低通过对BHK21细胞先天性免疫系统中多种信号分子进行基因敲除而实现。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述信号传导通路的降低通过对BHK21细胞先天性免疫系统中多种信号分子进行随机组合基因敲除而实现。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述多种信号分子选自由识别受体蛋白、效应蛋白、应激蛋白、蛋白激酶、干扰素及其下游调节产物组成的组中的一种或多种。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，对多种信号分子的基因敲除通过CRISPR/Cas9系统实现。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，对多种信号分子的基因敲除包括选取所述多种信号分子的至少两条靶序列，并针对每条靶序列，设计一对DNAoligo引物。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述靶序列通过分析金黄色地仓鼠的基因组序列获得。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，使用所述DNAoligo引物构建了pUC-gRNA-文库。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述DNAoligo引物选自由序列1-446组成的组中。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述病毒选自由伪狂犬病毒、日本脑炎病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒、新城疫病病毒组成的组中。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，建立了先天性免疫系统重构的BHK21细胞群。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，对先天性免疫系统重构的BHK21细胞群进行筛选，以获得最佳先天性免疫系统重构的BHK21细胞进行病毒增殖。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所获得的最佳先天性免疫系统重构的BHK21细胞增殖出的子代病毒在稀释至10-8依然产生阳性病变。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，采用gRNA表达载体骨架构建pUC-gRNA-文库，所述gRNA表达载体骨架内含U6启动子、RNA支架、polyA信号序列。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，pUC-gRNA-文库转染BHK21细胞期间采用与初始培养BHK21细胞时不同的培养基。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，pUC-gRNA-文库转染BHK21细胞期间采用Opti-MEM培养基。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，pUC-gRNA-文库转染BHK21细胞期间采用逐滴加入的方式混匀转染复合物。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，转染复合物包括聚乙烯亚胺试剂。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，转染前先更换初始BHK21细胞的培养基，然后预培养一段时间后，再进行转染。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征还在于，测定病毒增殖样品的效价时，所获得的细胞克隆经受了至少一次冻融。本专利技术提供一种增强病毒增殖的方法，其特征在于，包括：首先，分析金黄色地仓鼠的基因组序列，针对先天性免疫系统的各个识别受体蛋白、效应蛋白、应激蛋白、蛋白激酶、干扰素及其下游调节产物各自的基因序列，根据CRISPR/Cas9系统中基因编辑的序列识别要求，选取靶序列；每个基因序列挑选至少两条靶序列；针对每条靶序列，设计一对DNAoligo引物；每对靶序列引物分别进行退火处理，产生具有粘性末端的DNA双链；采用限制性内切酶处理gRNA表达载体骨架，产生与引物退火产物相同的粘性末端，经T4DNA连接酶作用，获得pUC-gRNA-文库，用于后续转染实验；接种初始细胞密度为1×106细胞/ml的BHK21细胞于6孔板中，培养过夜，转染前培养基更换为Opti-MEM培养基孵育10分钟；将100ul聚乙烯亚胺(PEI)试剂加入至1ml的Opti-MEM中混匀，将1～10ug的pCas9-IRES-GFP、pUC-gRNA-文库质粒载体加入至1ml的Opti-MEM中混匀，室温下孵育5分钟；孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增强病毒增殖的方法，其特征在于，所述病毒在进行了先天性免疫系统重构的BHK21细胞中进行增殖。

【技术特征摘要】
1.一种增强病毒增殖的方法，其特征在于，所述病毒在进行了先天性免疫系统重构的BHK21细胞中进行增殖。2.根据权利要求1所述的增强病毒增殖的方法，其特征还在于，BHK21细胞中的先天性免疫系统中的信号传导通路被降低。3.根据权利要求2所述的增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述信号传导通路的降低通过对BHK21细胞先天性免疫系统中多种信号分子进行随机组合基因敲除而实现。4.根据权利要求3所述的增强病毒增殖的方法，其特征还在于，所述信号传导通路中的多种信号分子选自由识别受体蛋白、效应蛋白、应激蛋白、蛋白激酶、干扰素及其下游调节产物组成的组中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的增强病毒增殖的方法，其特征还在于，构建了pUC-gRNA-文库用于转染BHK21细胞，且转染所述BHK21细胞期间采用与初始培养BHK21细胞时不同的培养基。6.根据权利要求5所述的增强病毒增殖的方法，其特征还在于，构建pUC-gRNA-文库所用的DNAoligo引物选自由序列1-446组成的组中。7.一种增强病毒增殖的方法，其特征在于，包括：首先，分析金黄色地仓鼠的基因组序列，针对先天性免疫系统的各个识别受体蛋白、效应蛋白、应激蛋白、蛋白激酶、干扰素及其下游调节产物各自的基因序列，根据CRISPR/Cas9系统中基因编辑的序列识别要求，选取靶序列；每个基因序列挑选至少两条靶序列；针对每条靶序列，设计一对DNAoligo引物；每对靶序列引物分别进行退火处理，产生具有粘性末端的DNA双链；采用限制性内切酶处理gRNA表达载体骨架，产生与引物退火产物相同的粘性末端，经T4DNA连接酶作用，获得pUC-gRNA-文库，用于后续转染实验；接种初始细胞密度为1×106细胞/ml的BHK21细胞于6孔板中，培养过夜，转染前培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯磊，陈丽，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32