通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果技术方案

真核细胞的先天性免疫系统能通过Ｔｏｌｌ样受体识别外来遗传物质，且能起始信号转导级联，由此通过干扰素应答触发细胞群的抗病毒状态。所述抗病毒状态也是非病毒基因输送系统的屏障。如果信号转导级联在细胞内或者细胞间被中断，则可以增加非病毒基因输送系统的转染效率并可以避免表达谱的不希望的改变。由于ＲＮＡ干扰有助于抗病毒状态，因此ＲＮＡｉ机构在先天性免疫系统活化后也被激活。在这种情况中，可以增加ｓｉＲＮＡ转染的敲低效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过影响先天性免疫系统改进非病毒输送系统的转染结果现有技术当机体对于感染性或者免疫学攻击呈现免疫应答时(Luke A. et al. ；Spektrum der Wissenschaft,August 2005,pages 68-75)，在先天性免疫应答(先天性免疫)与获得 性免疫应答(抗原特异性获得性免疫)之间有区别。获得性免疫仅在感染病原体的事件中发生。这是一种记忆性免疫，由此由相同病 原体导致的二次感染通常不引起该疾病的发作。这是疫苗所基于的原理。如果仅存在获得 性免疫，生物体则完全无对抗第一次感染的保护作用。然而不是这种情况，因为存在称作先 天性免疫的非常原始的免疫，且在从果蝇至哺乳动物的范围内均发现这种免疫，甚至在植 物中也发现此免疫。先天性免疫是对抗病原体的第一道防线，且在进化期间是非常古老的系统。在先 天性免疫的情况中，所谓的病原体相关的分子模式(PAMP)的疾病相关分子模式由所谓的 Toll 样受体(TLR)识另Ij (Heine H. et al.，Int. Arch. Allergy Immunol. 2003 ；130 ； 180-192 和 Uematsu S. et al.，J. Biol. Chem. 2007, May 25 ；282 (21) ；15319-23)以及由 RIG-I-样 解旋酶(RLH)识别，且引发合适的炎症和免疫反应。结果，该生物体能区分自身和非自身物 质。RLH在细胞溶质内遍在表达，在此其能识别在病毒感染情况下形成的dsRNA。TLR和RLH 属于也称作模式识别受体(PRR)的受体。Toll 样受体(TLR)Toll样受体最初在二十世纪九十年代中期发现(Zimmer A. et al. ；PNAS, 1999 ;96 (10) ,5780-5785)。其名称得自由 Christiane NUsslein-Volhard 在黑腹果蠅 (Drosophila Melanogaster)中发现的蛋白质，她将其命名为Toll。TLR蛋白类似该类型， 因此被称作“Toll-样”蛋白质。它们是这样的跨膜蛋白，具有细胞外“亮氨酸富集重复”结 构域(LRR)以及与家族同源的细胞质结构域。不同的TLR与不同的分子病毒和细菌成分选 择性反应，且通过信号转导级联控制相应的基因激活。在第一种情况中这通过所谓的适体 (adapter)分子及随后通过最终激活转录因子(例如NF- κ B及IRF家族)的激酶发生，所 述激活转录因子通过其磷酸化或者那些转录因子的相应细胞内抑制剂而进行。最后，除了 大量具有抗微生物作用的特定基因之外，产生所谓的细胞因子。细胞因子反过来是获得性 免疫的必要刺激物，且因此也将先天性免疫与获得性免疫联系起来。然而，对于配体识别、 信号转导以及信号传送仅有初步认知。迄今为止已知13种不同的TLR(其中10种是人类TLR)，其数目足以识别从细菌至 真菌以及病毒的所有病原体。受体识别所有致病生物体共有的结构，此外，还偶尔同时识别 许多组成成分，后者结构不相似。例如，TLR4识别脂多糖，但是也识别紫杉醇(taxol)。迄 今为止还未知TLR怎样能做到如此。TLR在物种与物种之间仅略有不同。迄今为止已知如下分子作为TLR的配体，其导致信号转导级联的触发TLRl 与TLR2形成异源二聚体，是来自酵母的三酰基脂蛋白和酵母聚糖的受体。TLR2 是某些肽聚糖、脂肽、糖脂和各种细菌的受体。TLR3 识别长dsRNA，在感染的细胞中病毒复制情况中发生。TLR4 是脂多糖(LPS，也称作内毒素)、各种外壳糖蛋白(也包括病毒的外壳糖蛋白)以 及紫杉醇的受体。LPS是细菌细胞壁的组成成分。TLR4受体发挥功能需要另外的膜结合蛋 白(TLR辅助蛋白)CD14，例如其结合LPS并提供给TLR4受体，与单独CD14的结合不触发 信号转导级联。TLR5 是鞭毛蛋白的受体，鞭毛蛋白是细菌借助其运动的纤毛(鞭毛)主要组成成分。TLR6 与TLR2形成异源二聚体，是二酰基脂蛋白和某些肽聚糖的受体。一种特殊的脂蛋 白(MALP-2 =巨噬细胞激活脂肽)通过膜结合蛋白CD36(TLR辅助蛋白)的辅助得以检测。TLR7 和 TLR8 是咪唑并喹啉和ssRNA/dsRNA的受体，例如RNA病毒的受体。TLR9 是细菌DNA或者非甲基化CpG基序的受体，其在许多细菌DNA中出现(比在哺乳 动物细胞中出现多20倍)。哺乳动物细胞中的CpG基序是高度甲基化的，结果是其可以被 区分。适用于细菌DNA的也适用于病毒DNA，其也通过TLR9检测。细菌DNA的免疫刺激 性质早在二十世纪八十年代即由Dr. Tokunaga研究小组报道。由Dr. Shizuo Akira领导 的小组鉴别TLR9受体是关联受体(通过基因靶向澄清Toll-受体的作用及其信号转导级 !^,Robert Koch lecture by Dr.Shizuo Akira,General Press Information 2002 ；www, robert-koch. stiftung. de)。TLRlO 目前还未知的配体。TLRll ^fji^^it^^WicJSff(uropathogenic bacterium Escherichia coli) 和原生动物Toxoplasma gondii的profilin样蛋白质的受体。TLRl2 功能和配体仍未知。TLRl3 功能和配体仍未知。TLR 的位置TLR2、4、5和6特别位于单核细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞或者骨髓树突细胞 的浆膜中，而TLR7、8和9特别位于免疫细胞的内涵体中(Siegmund-Schultze N.，www, aerzteblatt. de)。因此免疫应答的激活需要通过胞吞作用和内涵体的成熟而进行细胞内 摄取。信号传送在内涵体区室内开始。在TLR 3的情况中，表明其位于浆膜中，但是也有文 献描述推测其位于内涵体中。TLR通常成对起作用，且以各种组合出现在各种细胞类型中。信号转导级联尽管各种TLR 的信号转导途径(Perry Α. K. et al. ,Cell Research 2005 ；15(6)； 407-422 and Kawai Τ. et al. , J. Biochem. ；2007 ;141 ;137_145)具有一些相似性，但是 其也明确出现出相对较大的差异，最终导致不同的基因表达及因此不同的生物反应。除了 TLR3之外，所有TLR传送其信号至适体蛋白MyD88。MyD88在信号传送中通过TLR/白细胞 介素-1受体起关键作用。TLR的胞质结构域与白细胞介素-1受体的胞质结构域呈现出显 著相似性，因此该结构域也被称作Toll/IR-Ι受体结构域(TIR)。例如，MyD88-缺陷的脾细 胞呈现出与白细胞介素-1、LPS或者CpG-DNA无反应。此外，在MyD88_缺陷的细胞的情况 中，在与TLR2、TLR7、TLR9配体的反应中观测到无信号分子如NF- κ B或者MAP激酶激活。 这显著表明TLR (除TLR3之外)的信号传送对MyD88的竞争依赖性。其它适体分子是例如 TIRAP(含有适体蛋白(TLR1、TLR2、TLR4和TLR6)的To本文档来自技高网...

【技术保护点】
转染组合物，其包含：ａ）非病毒基因输送系统，所述非病毒基因输送系统包含：（ｉ）阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质；和／或（ｉｉ）一种化合物，其具有ＤＮＡ－和／或ＲＮＡ－结合结构域，且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移；和／或（ｉｉｉ）一种化合物，其与ＤＮＡ和／或ＲＮＡ共价结合，且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移；以及ｂ）至少部分抑制和／或激活先天性细胞内和／或细胞间免疫的工具，所述工具选自：（ｉ）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２或者ＴＬＲ１３的抗体；（ｉｉ）细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂；（ｉｉｉ）激酶ＭＥＫ１和／或ＭＥＫ２的抑制剂；（ｉｖ）ＴＬＲ７和／或ＴＬＲ８的激动剂，选自溴匹立明（２－氨基－５－溴－６－苯基－４－嘧啶酮）、咪唑并喹啉（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ）、噻唑并喹啉（ｔｈｉａｚｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ）和鸟苷类似物；以及（ｖ）其组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DE 2007-11-22 102007056488.2;DE 2008-3-28 10200801转染组合物，其包含a)非病毒基因输送系统，所述非病毒基因输送系统包含(i)阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质；和/或(ii)一种化合物，其具有DNA 和/或RNA 结合结构域，且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移；和/或(iii)一种化合物，其与DNA和/或RNA共价结合，且能触发受体介导的胞吞作用或者膜转移；以及b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具，所述工具选自(i)TLR 1、TLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体；(ii)细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂；(iii)激酶MEK1和/或MEK2的抑制剂；(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂，选自溴匹立明(2 氨基 5 溴 6 苯基 4 嘧啶酮)、咪唑并喹啉(imidazoquinolines)、噻唑并喹啉(thiazoloquinolines)和鸟苷类似物；以及(v)其组合。2.转染试剂盒，其包含a)非病毒基因输送系统，所述非病毒基因输送系统包含 (i)阳离子脂质、阳离子聚合物或者阳离子蛋白质；和/或( ) 一种化合物，其具有DNA-和/或RNA-结合结构域，且能触发受体介导的胞吞作用 或者膜转移；和/或(iii) 一种化合物，其共价结合DNA和/或RNA，且能触发受体介导的胞吞作用或者膜 转移；以及b)至少部分抑制和/或激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具，所述工具选自 (i)TLR UTLR 2、TLR 3、TLR 4、TLR 5、TLR 6、TLR 7、TLR 8、TLR 9、TLR 10、TLR 11、TLR 12或者TLR 13的抗体；( )细胞因子受体的抗体或者细胞因子受体拮抗剂；(iii)激酶MEKl和/或MEK2的抑制剂；(iv)TLR7和/或TLR8的激动剂，选自溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)、 咪唑并喹啉、噻唑并喹啉和鸟苷类似物；以及(ν)其组合。3.权利要求1或2的组合物或者试剂盒，特征在于所述非病毒基因输送系统包含阳离 子脂质。4.权利要求1-3任一项的组合物或者试剂盒，特征在于在a)中所述非病毒基因输送系 统包含如下式所示阳离子脂质 中是 其Rl 其中&和民独立地是其它十二烷基、十二烯基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯 基、十八烷基、十八烯基或其它烷基，在所有可能的组合中，它们是饱和的、不饱和的、支链 的、非支链的、氟化的或非氟化的，并由5-30个碳原子组成； X是 且其中m = 0 及 η =0;或者m = 0 及 η =1 ；或者m = 0 及 η =2;或者m = 1 及 η =1 ；或者m = 1 及 η =2;或者m = 2 及 η =2;以及g 是 1、2、3、4、5、6、7 或者 8 ；a 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；b 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；c 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；d 是 0、1、2、3、4、5或者6 ；e 是 0、1、2、3、4、5或者6，以及f 是 0、1、2、3、4、5或者6。5.权利要求4的组合物或者试剂盒，特征在于R2和R3独立地是其它十二烷基、十二烯 基、十四烷基、十四烯基、十六烷基、十六烯基、十八烷基、或者十八烯基；m禾口 η是1 ；g 是 1、2、3、4、5、6、7 或者 8 ； a 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 b 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 c 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 d 是 0、1、2、3、4、5 或者 6 e是0、1、2、3、4、5或者6，以及 f 是 0、1、2、3、4、5 或者 6。6.权利要求1-5任一项的组合物或者试剂盒，其含有修饰的或者未修饰的遗传物质，尤其是修饰的或者未修饰的ssDNA，修饰的或者未修饰的dsDNA，修饰的或者未修饰的 ssRNA，修饰的或者未修饰的dsRNA和/或修饰的或者未修饰的siRNA。7.权利要求1-6至少一项的组合物或者试剂盒，特征在于其中至少部分抑制和/或 激活先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是1，4_ 二氨基-2，3- 二氰-1，4- 二(ο-氨 基苯基巯基)丁二烯(U0126)；咪喹莫特(R837，l-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5_c]喹 啉-4-胺)；瑞喹莫德(R848，4-氨基-2-(乙氧基甲基)_a，a_ 二甲基-IH-咪唑并[4， 5-c]喹啉-1-乙醇)；GardiquimocKl-(4-氨基-2-乙基氨基甲基咪唑并[4，5_c]喹 啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇)；CL075 ；CL097 ；洛索立宾(7-烯丙基-7，8- 二氢_8_氧-鸟 苷)；艾沙托立宾(7-硫代-8-氧鸟苷)；溴匹立明(2-氨基-5-溴-6-苯基-4-嘧啶酮)； 或其任何组合。8.权利要求1-7至少一项的组合物或者试剂盒，特征在于至少部分抑制和/或激活先 天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是TLR 3、TLR 7、TLR 8或者TLR 9的抗体。9.权利要求1-8至少一项的组合物或者试剂盒，特征在于至少部分抑制和/或激活 先天性细胞内和/或细胞间免疫的工具是白细胞介素-1受体的抗体或者拮抗剂，特别是 IL-ra的抗体或者拮抗剂；I型干扰素受体的抗体或者拮抗剂；Y _干扰素受体的抗体或者 拮抗剂或者肿瘤坏死因子受体的抗体或者拮抗剂。10.权利要求2-9任一项的试剂盒，其中 (i)所有成分均彼此完全...

【专利技术属性】
技术研发人员：R克勒泽，S柯尼希，
申请(专利权)人：BIONTEX实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：DE