一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术制备的抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14701，保藏日期为2017年9月5日。抗西布曲明特异性单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.14701的杂交瘤细胞株170502所分泌产生。此细胞株分泌的单克隆抗体，对西布曲明具有较好的特异性（IC50值4.3ng/mL），可以用于食品安全中西布曲明的特异性检测。

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
西布曲明(Sibutramine)，为减肥药。饮食控制、运动不能减轻和控制体重的肥胖症治疗，包括减轻体重和维持体重的减轻，治疗应与低热量饮食和运动结合进行。从2002年12月起，一项被称为SCOUT(SibutramineCardiovascularOutcomeTrial)的大规模实验启动。总共有9800名肥胖症病人和超重者参与了这个实验。参加者都在55岁以上，有过心脏病和糖尿病史，只是近期没有复发。整个实验时间长达六年。将SCOUT实验组与服用安慰剂的对照组相比，服用西布曲明者平均至多减掉2公斤到4公斤。而且这种效果在停药之后能否保持也不清楚。而西布曲明带来了严重但并非致命的心血管疾病风险，如中风、心脏病发作。这项研究直接导致了西布曲明在欧盟的禁止。中国药监局2010年10月30日叫停在中国大陆生产销售，原因就在于西布曲明导致心脑血管病症的发生率。但由于西布曲明药物价格低廉，且确有一定的抑食减肥功效，屡被一些不法商家巧妙加入减肥食品中牟取暴利。目前国内外对西布曲明的检测多采用高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱与质谱联用法（LC-MS）、气质联用法（GC-MS）等。上述检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广，无法达到现场大批量快速检测的要求。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，提供一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，其能够分泌对西布曲明具有较高亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体，为间接竞争ELISA试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定基础，可以用来建立西布曲明酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析技术快速检测方法。按照本专利技术提供的技术方案，一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14701，保藏日期为2017年9月5日。抗西布曲明特异性单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.14701的抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502分泌产生。所述抗西布曲明特异性单克隆抗体的应用，将其应用在食品安全中西布曲明的分析检测。本专利技术提供的分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502的制备步骤为：（1）免疫原的制备与鉴定：以西布曲明为起始反应物，通过氯取代反应衍生出带有氨基的西布曲明衍生物，作为半抗原；然后通过戊二醛法使该半抗原与蛋白载体的羧基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG2000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株；（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：IC50值和亲和力的测定通过ELISA法。本专利技术的有益效果：本专利技术获得的抗西布曲明单克隆抗体细胞株分泌的单抗，对西布曲明有较好的检测灵敏度和亲和力，为西布曲明的检测提供了有效的方法。生物材料样品保藏：一株抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.14701，保藏日期为2017年9月5日，分类命名为单克隆细胞株。附图说明图1是西布曲明单克隆抗体对西布曲明的标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将西布曲明完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对西布曲明有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502的制备（1）完全抗原的合成：取8mg西布曲明半抗原溶解于500µLDMF（N,N-二甲基甲酰胺）中，然后将10µL戊二醛在冰浴条件下滴加入上述溶液中，冰浴条件下搅拌活化20min；另取18mgKLH（钥孔血蓝蛋白）溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CBS（碳酸盐缓冲溶液）溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，冰浴条件下搅拌反应4h后，4℃透析三天，-20℃分装保存。（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取西布曲明完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后21天冲刺免疫，准备融合。（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比5-10:1的比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用西布曲明为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对西布曲明有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株。（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14701，保藏日期为2017年9月5日。

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗西布曲明特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株170502，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14701，保藏日期为2017年9月5日。2.抗西布曲明特异性单克隆抗体，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，孙佳佳，胥传来，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32