抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株UMAB159(保藏编号为CGMCC No.15596)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。本发明专利技术还涉及UMAB159分泌产生的单克隆抗体在制备用于检测波形蛋白(Vimentin，VIM)的免疫检测工具中的应用，含该单克隆抗体的免疫组织化学检测试剂盒，以及该单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与VIM蛋白特异性结合，显著提高了VIM蛋白免疫检测的特异性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】
抗波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体及其用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种杂交瘤细胞株UMAB159的开发、其分泌产生与波形蛋白(Vimentin，VIM)特异性结合的单克隆抗体的制备以及这种单克隆抗体应用于诊断的方法和用途。
技术介绍
波形蛋白(Vimentin，VIM)是由466个氨基酸组成的，分子量大小约为57kDa的一种中间丝蛋白，在非螺旋状的N起始端和C末端分别有一高保守的螺旋形态的杆状结构域，被称作77-残基头端和61-残基尾端。VIM蛋白主要表达于间充质细胞及中胚层衍生来的细胞：1.间充质细胞包括纤维细胞、内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等；2.中胚层衍生来的细胞包括间皮细胞、表面上皮细胞及颗粒细胞、肌上皮细胞等。VIM蛋白主要功能在于维持细胞形态、稳定细胞骨架、参与有丝分裂和细胞分解、推进细胞粘连及移行等。大量文献报道在多种不同的肿瘤中，VIM蛋白表达量增加。例如，在前列腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌，肝癌，恶性黑色素瘤，中枢神经系统肿瘤和胃肠道肿瘤包括胰腺，结直肠癌中，VIM蛋白呈现阳性表达。一个流行的理论(RobertWeinberg)认为癌细胞在转移前要经过一个从表皮细胞到间充质细胞的转化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)的过程，并且VIM蛋白的表达水平被认为在EMT过程中的一个重要的间充质细胞标记物，因此，在癌细胞中的VIM蛋白的过量表达导致了癌细胞转移及侵袭。总而言之，VIM蛋白不仅为肿瘤检测提供一个指标，对肿瘤的发生和进展都起着重要作用。目前临床上主要通过免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)病理实验检测肿瘤组织中VIM蛋白的表达状况，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对VIM蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种能分泌产生抗VIM蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其生产的抗VIM蛋白的单克隆抗体和应用，提高所述单克隆抗体与VIM蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种能分泌产生抗VIM蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株UMAB159，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为CGMCCNo.15596。本专利技术还提供了一种特异性结合VIM蛋白的单克隆抗体，有上述杂交瘤细胞株UMAB159分泌产生。本专利技术所述能分泌产生抗VIM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其生产的单克隆抗体UMAB159的制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：根据VimentinORF核苷酸序列(VimentinORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，1398bp；Vimentin氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，466aa)；设计引物PCR扩增VimentinORF第628bp位到第1398bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His(购于Origene公司)，构建Vimentin的重组表达质粒pET23a-His-rVimentin；(2)Vimentin重组蛋白的表达与纯化：将Vimentin重组表达质粒转化E.coli细胞，裂解离心获得可溶性蛋白，经镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的Vimentin重组蛋白；(3)单克隆抗体杂交瘤细胞筛选及其生产的单克隆抗体制备：采用上述Vimentin重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗Vimentin蛋白的特异性抗体杂交瘤细胞株，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得Vimentin单克隆抗体。通过蛋白印记(Western-blot，WB)、免疫组织化学实验(IHC)验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗VIM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞，命名为UMAB159，亚型鉴定为IgG1，并于2018年04月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.：15596。本专利技术还提供了单克隆抗体在制备用于检测VIM蛋白的免疫检测工具中的应用。作为优选，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本专利技术还提供了一种免疫组织化学检测试剂盒，包括保藏编号为CGMCCNo.：15596的杂交瘤细胞分泌产生抗VIM蛋白的单克隆抗体，可检测组织细胞中VIM蛋白的表达状况。此外，本专利技术还提供保藏编号为CGMCCNo.：15596的杂交瘤细胞分泌产生的抗VIM蛋白单克隆抗体在制备标记肿瘤细胞试剂盒中的应用。作为优选，所述肿瘤包括结肾癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌。本专利技术提供的杂交瘤细胞UMAB159可稳定分泌产生抗VIM蛋白单克隆抗体，且与VIM蛋白特异性结合，显著提高了VIM蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，广泛适用于各种肿瘤组织中VIM蛋白表达的检测。生物保藏信息说明用于保藏分泌抗VIM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株UMAB159的分类命名为：鼠抗人波形蛋白(VIM)单克隆杂交瘤细胞株；保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年04月26日；保藏编号为CGMCCNo.：15596。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1所示为实施例1中克隆位点图；图2所示实施例2重组VIM蛋白的Westernblot检测结果图，以anti-His检测重组VIM蛋白在E.Coli细胞中的表达，其中泳道L为转染空载体的E.Coli细胞裂解液为抗原的检测结果、泳道R为转染pET-His-rVimentin质粒的E.Coli细胞裂解液抗原的检测结果；图3示实施例2重组VIM蛋白SDS-PAGE结果图，用镍亲和层析柱纯化重组VIM蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；图4所示为实施例3以杂交瘤细胞UMAB159分泌产生的单克隆抗体识别肿瘤细胞系Hela和A549及内源细胞系COS7，Jurkat和MDCK中的VIM蛋白的Westernblot检测结果图；图5示实施例4肾癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为抗VIM蛋白单克隆抗体，1:300)；图6示实施例4卵巢癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为抗VIM蛋白单克隆抗体，1:300)；图7示实施例4子宫内膜癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为抗VIM蛋白单克隆抗体，1:300)图8示实施例4结肠癌组织免疫组织化学检测结果图(一抗为抗VIM蛋白单克隆抗体，1:300)；具体实施方式本专利技术公开了分泌抗VIM蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞UMAB159及其产生的抗VIM蛋白单克隆抗体和应用。下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种杂交瘤细胞株UMAB159，其特征在于：分泌产生与波形蛋白(Vimentin，VIM)特异性结合的单克隆抗体，这种杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCC No.15596。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株UMAB159，其特征在于：分泌产生与波形蛋白(Vimentin，VIM)特异性结合的单克隆抗体，这种杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCCNo.15596。2.一种单克隆抗体，其特征在于：特异性结合VIM蛋白，这种抗体由保藏编号为CGMCCNo.15596的杂交瘤细胞株UMAB159分泌产生。3.根据权利要求2所述的单...

【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东晖，张乾坤，魏海涛，叶露，王成林，任琪，钮倩，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32