本发明专利技术提供了杂交瘤细胞株C11‑6F7，以及由该细胞株产生的HCMV单克隆抗体和应用。杂交瘤细胞株C11‑6F7保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017196。HCMV单克隆抗体可应用在免疫测定方法中，本发明专利技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述HCMV单克隆抗体。本发明专利技术利用截短的PP65基因C末端642个基因表达PP65‑C214蛋白，降低成本同时也降低了重组抗原的表达难度，且获得的重组抗原纯度较高；该单克隆抗体灵敏度较高，特异性强，应用在免疫荧光和流式细胞技术方面，能够对感染细胞进行检测，并可反映HCMV感染的活跃状态。
【技术实现步骤摘要】
杂交瘤细胞株C11-6F7及其产生的HCMV单克隆抗体和应用
本专利技术涉及一种单克隆抗体领域，尤其涉及杂交瘤细胞株C11-6F7及其产生的HCMV单克隆抗体和应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)为β属疱疹病毒亚科，双链线性DNA病毒。传播途径多样，可经胎盘或生殖道上行感染，亦可经乳汁、血液、唾液等传播，感染后终身携带，病毒具有广泛的靶细胞，可侵犯全身各器官，所以临床症状复杂多变。巨细胞病毒在发展中国家的感染率为90％以上，相当普遍，虽然大多数成人感染者并无明显的临床症状(潜伏感染)，但对胎儿、新生儿或者有免疫缺陷的个体会带来严重疾病。HCMV是先天性感染最常见的病原体之一，通过胎盘侵袭胎儿可引起死胎、流产、胎儿畸形等损害，无明显临床症状的先天性感染新生儿中约有10％-15％会产生明显的后遗症如智力障碍等；同时HCMV也是引起机体免疫功能低下的人群如HIV或器官移植患者并发感染死亡的常见病原体。因此，HCMV的早期快速检测以便及时给予患者抗病毒药物治疗显得至关重要。近年来流式细胞分析技术已成为临床检验医学发展的一个热点，其工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、高通量的定量分析，能同时从一个细胞中测得多个参数，能快速获得精确的实验结果，随着检测技术的不断完善，流式细胞分析对象已从原来的细胞膜成分向细胞内成分发展。病毒性疾病的诊断主要依赖于实验室检查，但细胞分离培养病毒非常耗时，同时病毒的特异性抗体检出率往往较低。利用流式细胞技术既可以检测到细胞表面吸附的病毒抗原，又可以检测到感染细胞内的病毒抗原，通过荧光标记的特异性识别病毒抗原的单克隆抗体可以快速定量检测出感染的细胞。目前国内检测HCMV的方法主要有荧光定量PCR或者ELISA等方法，核酸检测试剂盒虽然具有灵敏度高特异性强等特点，但其检测的信号是核酸(包括潜伏感染)，无法区分活动性感染和潜伏感染，无法解决活动性感染的问题。ELISA等免疫法所用抗体为多克隆抗体，具有纯度及稳定性无法保障等问题，所以对于其应用在活动性感染检测中存在灵敏度低、特异性不高等缺点。因此，需要获得高质量HCMV单抗，以建立免疫学方法HCMV检测试剂盒。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了杂交瘤细胞株C11-6F7，以及由该细胞株产生的HCMV单克隆抗体和应用。该人巨细胞病毒单克隆抗体灵敏度较高，能特异性结合PP65-C214蛋白；用该单抗制备的试剂盒在流式细胞平台上的应用能满足临床检测要求，检测准确度与目前市售的核酸检测试剂盒一致，性能优于进口试剂盒。本专利技术提供的杂交瘤细胞株C11-6F7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2017196，保藏日期为2017年9月21日，保藏地点为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。本专利技术还提供了一种鼠源性抗HCMV单克隆抗体，所述抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2017196的杂交瘤细胞株C11-6F7分泌产生，识别抗原为UL83编码的pp65蛋白C末端214个氨基酸。本专利技术还提供了HCMV单克隆抗体在免疫测定方法中的应用，包括在流式细胞技术、ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法和免疫组化染色测定法等方面的应用。本专利技术还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述HCMV单克隆抗体。本专利技术提供了高特异性识别HCMV单克隆抗体，应用在免疫荧光和流式细胞技术方面，能够对感染细胞进行检测，并可反映HCMV感染的活跃状态。本专利技术利用截短的PP65基因C末端642个基因表达PP65-C214蛋白，降低成本同时也降低了重组抗原的表达难度，且获得的重组抗原纯度较高；用该单抗制备的试剂盒在流式细胞平台上的应用能满足临床检测要求，检测准确度与目前市售的核酸检测试剂盒一致，性能优于进口试剂盒。附图说明图1是重组抗原PP65-C214蛋白纯化的SDS-PAGE电泳结果图；图2是Westernblot检测PP65-C214单抗特异性结果图；图3是抗体6F7与进口试剂盒抗体分别用间接流式法检测样本后测得的平均荧光强度对比图；其中图A为抗体6F7用间接流式法检测样本后测得的平均荧光强度图，图B为进口试剂盒抗体用间接流式法检测样本后测得的平均荧光强度图。图4是用间接免疫荧光法将本专利技术单抗与进口试剂盒分别对临床样本进行对比检测的结果图；其中，图A为本专利技术单抗制备的试剂盒对临床样本进行检测的结果图；图B为进口试剂盒对临床样本进行检测的结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本说明书实施例中所涉及病毒、细胞株等术语及试剂说明如下：HCMV：人巨细胞病毒；PP65：UL83编码的抗原蛋白；6F7：抗HCMV-pp65单克隆抗体；VH-F/R混合物：单链抗体重链扩增引物；VL-F/R混合物：单链抗体轻链扩增引物；Trizon：从天根公司购买；M-MLV：反转录酶；Taq：从Promega公司购买。实施例1：HCMV-pp65-C214单克隆抗体的获得制备抗HCMV-pp65-C214单克隆抗体按如下步骤进行：1.免疫原的制备：从NCBI中找出UL83编码的蛋白序列，其C末端214个氨基酸按原核表达密码子优化后合成基因序列，连接至原核表达载体pet30a中，经IPTG诱导表达。包涵体经超声波破碎后沉淀用8M尿素溶解再过镍柱纯化，20mM咪唑洗涤杂蛋白，分别收集50mM、100mM、200mM咪唑洗脱下来的蛋白，洗脱产物跑SDS-PAGE鉴定，电泳结果如图1所示，图中标注PP65-C214的为200mM咪唑洗脱下来的目的蛋白，纯化的SDS-PAGE结果电泳图。由图1可见，所得到的免疫原蛋白大小与预期大小吻合，初步鉴定为目标蛋白。经鉴定过的重组蛋白-80℃保存待用。2.复性：新的透析袋用蒸馏水煮5-10min，取出擦干，装水检漏，待用。从-80℃取出重组蛋白约6ml，已知OD约0.678，加入透析袋中，对1L0.02MPBS(pH7.2)+6M尿素于4℃透析过夜，期间用磁力搅拌器不断搅拌；取出，再继续用4/3/2/1/0M尿素+PBS对其4℃透析各1-2小时，取出重组蛋白离心，12000RPM离心1min，取上清至另一干净的EP管中，测OD约0.530，-80℃保存待用，该蛋白称之为重组抗原PP65-C214。3.用上述复性的重组抗原PP65-C214免疫小鼠，制备单克隆抗体，具体步骤如下：用复性后的免疫原对小鼠进行初次免疫及两次加强免疫，制备脾脏细胞，并将其与处于生长对数期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，获得杂交瘤细胞。上述所得杂交瘤细胞经过有限稀释法进行单克隆，再通过间接ELISA筛选出阳性单克隆细胞株。单克隆后的细胞经注射入弗氏不完全佐剂预免的小鼠腹腔，诱导产生腹水。实施例2：间接ELISA测所得腹水效价及灵敏度2.1腹水效价：实施例1中得到的抗原PP65-C214用碳酸盐缓冲液作为包被液，将其稀释后包被96本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.杂交瘤细胞株C11‑6F7，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2017196。
【技术特征摘要】
1.杂交瘤细胞株C11-6F7，其特征在于，所述杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2017196。2.一种鼠源性抗HCMV单克隆抗体，其特征在于，所述抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2017196的杂交瘤细胞株C11-6F7分泌产生。3.权利要求2...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小锋，李晨阳，刘铭龙，邓国亮，李园枚，庞妙桦，
申请(专利权)人：广东和信健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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