本发明专利技术涉及一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CGMCC No.14699，是将BALB/c小鼠用完全弗氏佐剂进行首次免疫，不完全弗氏佐剂进行3次加强免疫，不含佐剂的噻虫嗪完全抗原进行1次冲击免疫，使得BALB/c小鼠获得免疫；将高效价低IC50的获得免疫的小鼠脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到的细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对噻虫嗪具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.81ng/mL)可以用于食品中噻虫嗪的残留检测。
【技术实现步骤摘要】
一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
噻虫嗪(Thiamethoxam，TMX)是先正达公司1991年研发的第二代新烟碱杀虫剂；从结构上看，以2-氯-5-噻唑基和甲基作为药效基团是对恶二嗪先导物最理想的修饰结合；从作用靶标看，作为乙酰胆碱受体抑制剂干扰昆虫神经信号传导，方式新颖；从杀虫活性看，比第一代新烟碱杀虫剂活性更强，且使用方式多样化；从作用范围看，它对几乎所有咀嚼式口器和绝大多数刺吸口器害虫均有优良防效，尤其在控制对常规杀虫剂产生抗性的害虫方面优势突出；从安全性看，它对哺乳动物低毒，无致畸、致突变效应。基于以上优点，近年来噻虫嗪在农业生产中被广泛应用，不仅使许多靶标害虫产生了抗药性，而且其在农产品中的高水平残留对消费者造成了潜在威胁。噻虫嗪的传统检测方法有气质联用法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和毛细管电泳质谱联用法等，然而这些方法的前处理比较复杂、费时，不适用于大量样品的快速检测，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对噻虫嗪的高效、快速的检测方法。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测，然而，使用酶联免疫法检测噻虫嗪的前提是得到对噻虫嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体，因此，找到一种制备对噻虫嗪具有高特异性和高灵敏度的单克隆抗体的方法十分关键。专利技术人尝试通过杂交瘤细胞制备噻虫嗪单克隆抗体，但在制备能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的过程中，如何制备噻虫嗪半抗原和噻虫嗪完全抗原、如何使小鼠产生强免疫，还需进一步的研究；如何使得制备出的杂交瘤细胞株能够成功分泌出噻虫嗪单克隆抗体，还需进一步的研究；如何使得分泌出的噻虫嗪单克隆抗体特异性强、灵敏度高，也还需进一步的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是获得一种能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株。此杂交瘤细胞株分泌的噻虫嗪单克隆抗体对噻虫嗪具有较好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.81ng/mL)，可以用于建立噻虫嗪的免疫学检测方法，检测食品中噻虫嗪的残留。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14699，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术提供了上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：步骤1：制备噻虫嗪半抗原及噻虫嗪完全抗原，将获得的噻虫嗪完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中噻虫嗪抗体含量高的获得免疫的小鼠；步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的噻虫嗪完全抗原进行；步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；所述步骤1中的噻虫嗪半抗原的分子式如下：所述步骤1中的噻虫嗪完全抗原的分子式如下：在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲击免疫之间间隔18～21天。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤2、4中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲击免疫剂量为25μg/只。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤2、4中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲击免疫；在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是在冲击免疫结束3天后进行。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤5中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤5中的培养基为RPMI-1640培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤5中的亚克隆次数为3次。本专利技术提供了上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或上述一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。本法明提供了一种噻虫嗪半抗原，所述噻虫嗪半抗原的分子式如下：本专利技术提供了上述一种噻虫嗪半抗原的制备方法，所述方法为将二甲亚砜(DMSO)溶解于噻虫嗪(TMX)，加入氢氧化钾，搅拌并滴加β-巯基丙酸溶液，升温进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却后，加入水，以HCl调反应液pH，以二氯甲烷萃取，得到提取液；提取液经干燥、浓缩、结晶，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将20mL二甲亚砜(DMSO)溶解于5.8g噻虫嗪(TMX)，加入2.25g氢氧化钾，边搅拌边滴加β-巯基丙酸溶液，油浴升温至100℃进行反应，得到反应液；待反应液自然冷却至室温后，加入50mL水，以6mol/L的HCl调反应液pH至3，以90mL二氯甲烷萃取，得到提取液；提取液经无水NaSO4干燥、浓缩、结晶，得到黄色晶体，即为噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-巯基丙酸溶液是通过将β-巯基丙酸溶解于DMSO得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述β-巯基丙酸溶液是通过将2.1g的β-巯基丙酸溶解于10mL的DMSO得到的。本专利技术提供了上述一种噻虫嗪半抗原或上述一种噻虫嗪半抗原的制备方法在在制备噻虫嗪完全抗原、分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株、噻虫嗪单克隆抗体方面的应用。本专利技术提供了一种噻虫嗪完全抗原，所述噻虫嗪完全抗原的分子式如下：本专利技术提供了上述一种噻虫嗪完全抗原的制备方法，所述方法为将噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌进行反应，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，搅拌进行反应，得到A液；将钥孔血蓝蛋白(KLH)用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到B液；将A液加入到B液中进行反应，得到反应液；用PBS溶液透析反应液，得到完全抗原(TMX-COOH-KLH)。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为将2.8mg噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)、2.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解于300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min，得到噻虫嗪半抗原(TMX-COOH)溶液；将4.8mgN,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解于100μL无水DMF后，加入到TMX-COOH溶液中，室温搅拌进行反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14699，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【技术特征摘要】
1.一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14699，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.如权利要求1所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤1：制备噻虫嗪半抗原及噻虫嗪完全抗原，将获得的噻虫嗪完全抗原制备成弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；步骤2：将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；步骤3：将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，删选出血清中噻虫嗪抗体含量高的获得免疫的小鼠；步骤4：将删选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲击免疫，冲击免疫采用不含弗氏佐剂的噻虫嗪完全抗原进行；步骤5：将进行冲击免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株；所述步骤1中的噻虫嗪半抗原的分子式如下：所述步骤1中的噻虫嗪完全抗原的分子式如下：3.权利要求1所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的一种分泌噻虫嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法在制备噻虫嗪单克隆抗体方面的应...
【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，叶丽雅，胥传来，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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