一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术包括一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏日期为2017年9月5日。马兜铃酸A单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCC No.14688，马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709分泌产生。所述马兜铃酸A单克隆抗体的应用，用于中药材中马兜铃酸A分析检测。本发明专利技术细胞株分泌的单克隆抗体，对马兜铃酸A具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为4ng/mL），可实现对中药材中马兜铃酸A检测，为中药材中马兜铃酸A的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
马兜铃酸（Aristolochicacids，简称AAs），被称为马兜铃总酸、增噬力酸或木通甲素，是一类硝基菲羧酸，马兜铃酸类化合物是马兜铃科马兜铃属植物特有的一类硝基菲类化合物，包括马兜铃酸A、B、C和D等。近年来,马兜铃酸的肾毒性已引起广泛关注，各国纷纷对含马兜铃酸的中药采取管制及限制措施。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，马兜铃酸、含马兜铃酸的植物在一类致癌物清单中。研究表明,马兜铃酸类化合物的毒性主要由马兜铃酸A或其代谢物马兜铃内酰胺所致。因此,在检测马兜铃酸时，常选择马兜铃酸A为指标性成分。马兜铃科药用植物在我国广泛使用，由于马兜铃科植物许多名称混淆，为确保临床用药的安全有效，对于疑含有马兜铃酸类物质的药用植物及制剂必须进行严格检测，制订限量用药标准。目前，检测马兜铃酸A的方法主要有薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法及酶联免疫分析法等。薄层色谱法和紫外分光光度法灵敏度较低；高效液相色谱法(HPLC)灵敏度较高、测定准确，是目前测定马兜铃酸A最常用的方法，但仪器设备昂贵，对实验人员专业技能要求高。酶联免疫分析法具有灵敏、准确、前处理简单、适合大通量筛选等优点，在医学诊断、食品安全检测、环境污染物监测等领域已得到广泛应用。本专利技术制备了马兜铃酸A的单克隆抗体,建立了马兜铃酸A的酶联免疫分析技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709及其应用，由该细胞株制备的抗体对马兜铃酸A具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立马兜铃酸A的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14688，保藏日期为2017年9月5日。马兜铃酸A单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.14688，马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709分泌产生。所述马兜铃酸A单克隆抗体的应用，用于中药材中马兜铃酸A分析检测。杂交瘤细胞株的制备方法如下：（1）半抗原的制备：原药Mol.Wt:341.272由于AAs化学结构式中含有活泼基团（羧基），因此本专利技术将原药直接作为半抗原。本专利技术采用碳二亚胺（EDC）将AAs半抗原的羧基与载体蛋白上的氨基偶联以制备完全抗原。（2）完全抗原AAs-EDC-BSA的制备：称取马兜铃酸A1.4mg，加入500μLDMF溶解，充分溶解后向其中加入EDC2.5mg和NHS1.6mg，并于30℃搅拌6h，作为A液。称取10mg的BSA，加入5mLCB溶解，作为B液。将A液滴加入B液中，偶联12h，混合液用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原AAs-EDC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；（3）小鼠免疫：将AAs完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫采用马兜铃酸A的完全抗原与完全弗氏佐剂混合，剂量为100μg/只；多次加强免疫采用马兜铃酸A的完全抗原与不完全弗氏佐剂混合，剂量为50μg/只；最后一次用马兜铃酸A完全抗原与生理盐水混合冲刺免疫。采用腹腔注射，剂量为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得AAs的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株SS0709；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株SS0709分泌的单克隆抗体，对AAs具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为4ng/mL），可实现对中药材中AAs的检测，为中药材中AAs免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2017年9月5日，保藏编号为CGMCCNo.14688，分类命名为单克隆细胞株。附图说明图1是马兜铃酸A单克隆抗体的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过小鼠免疫，细胞融合，ic-ELISA筛选，杂交瘤细胞有限稀释亚克隆，最终得到了针对马兜铃酸A的具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株SS0709的制备（1）半抗原：马兜铃酸A化学结构式中含活泼基团（-COOH），即可直接作为半抗原。（2）完全抗原的制备：称取马兜铃酸A1.4mg，加入500μLDMF溶解，充分溶解后向其加入EDC2.5mg和NHS1.6mg，并于30℃搅拌6h，作为A液。称取10mg的BSA，加入5mLCB溶解，作为B液。将A液滴加入B液中，偶联12h，混合液用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原AAs-EDC-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；（3）小鼠免疫：将AAs完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫直接用生理盐水稀释后腹腔注射，减半为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10%FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5%CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1-4）*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14688，保藏日期为2017年9月5日。

【技术特征摘要】
1.一株马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14688，保藏日期为2017年9月5日。2.马兜铃酸A单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.14688，马兜铃酸A单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0709分泌产生。3.权利要求2所述马兜铃酸A单克隆抗体的应用，其特征在于：用于中药材中马兜铃酸A分析检测。4.权利要求1所述杂交瘤细胞株所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，李少珍，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32