一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术制备了吡哆醇完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，得到一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14687，保藏日期为2017年9月5日。此细胞株分泌的单克隆抗体，对吡哆醇具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50为250 ng/mL）。本发明专利技术成果可用于建立婴幼儿食品、乳品和特殊医学用途食品中吡哆醇含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
吡哆醇属于B族维生素，是具有维生素B6作用的物质之一，也称为抗皮炎素或维生素B6，广泛存在于食品中并且可作为膳食补充剂。吡哆醇在生物体内容易变成作为辅酶的吡哆醛-5-磷酸参与机体新陈代谢。缺少吡哆醇的动物，蛋白质转变为碳水化合物和脂肪将受到阻抑，亦会出现鼻炎、口炎和皮炎。此外缺乏维生素B6还会引起各种脏器的动脉硬化症。由于吡哆醇在中枢神经系统中起着重要的作用，因此缺乏吡哆醇会引起痉挛，给予吡哆醇便可很快恢复。吡哆醇用于治疗和预防吡哆醇缺乏、铁粒幼细胞性贫血、吡哆醇依赖性癫痫及某些代谢紊乱，因此食品中吡哆醇的控制尤为重要。目前吡哆醇含量分析方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用(LC-MS)等仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的吡哆醇检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708及其应用，由该细胞株制备的抗体对吡哆醇具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立吡哆醇的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14687，保藏日期为2017年9月5日。吡哆醇单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCCNo.14687，吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708分泌产生。所述吡哆醇单克隆抗体的应用，用于建立吡哆醇含量的免疫检测方法，将其应用于残留吡哆醇的检测中。所述检测领域为婴幼儿食品、乳品或特殊医学用途食品中。所述吡哆醇免疫原Pyr-KLH的制备方法，主要包括以下步骤：（1）半抗原Pyr的制备：将吡哆醇（20g，118mmol）溶解于200mL丙酮中，加入200mL2，2-二甲氧基丙烷和对甲苯磺酸（81.4g，473mmol），130℃搅拌过夜。将反应混合物倒入冰水中冷却并用DCM提取水相。混合有机相并用盐水洗涤，Na2SO4干燥浓缩。用乙醚重结晶所得产物。将混合物过滤，得到白色固体化合物2；0℃氮气下，将NaH（6.88g，287mmol，60%有机相）的溶液加入到70mLTHF中。加入溶解在200mLTHF中的化合物2（15g，71.7mmol）。回流30min，冷却至室温后，加入苄基溴（24.5g，143mmol），再次回流4h，然后用二氯甲烷萃取。收集有机提取物，用盐水洗涤，干燥浓缩，得到深棕色油状物。用硅胶柱纯化残留物，得到棕色油状物3；化合物3（12g，40.1mmol）的水溶液中加入24mL98%甲酸。50℃搅拌24h，然后用饱和NaHCO3溶液将其调节至pH7。中和后，用二氯甲烷多次萃取反应混合物。将有机萃取物干燥浓缩，得到深棕色固体，用快速色谱法纯化粗产物，得到化合物4；0℃氮气下，将苄基二甲基苯基氯化铵（7.60g，26.6mmol）溶解于30mL无水甲醇中，将该溶液加入到甲醇钠（1.80g，34mmol）溶液中。然后向混合物中加入60mL化合物4（4.50g，17.4mmol）的甲醇溶液中。室温下搅拌20min，蒸发浓缩混合物并将其加入到含有500毫升热甲苯的圆底烧瓶中。反应30min后，将混合物浓缩。反应后，油残渣溶解在饱和氯化铵溶液中，然后用二氯甲烷萃取。将有机提取物干燥浓缩。将有机萃取物经硅胶柱纯化，得到化合物5；含化合物5（2.60g，169mmol）的60mL甲苯溶液加入CS2CO3（3.70g·114mmol）和丙烯酸乙酯（2.80g，22.6mmol），85℃搅拌过夜。将反应混合物冷却并倒入水中，然后用HCl将溶液调至pH7，用EA萃取水相。混合有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥并浓缩。用硅胶柱纯化残留物，得到化合物6；含化合物6（1.60g，3.50mmol）的THF/H2O（16.0/4.00mL）溶液加入LiOHH2O（34.7mg，890mmol），室温下搅拌过夜。然后用HCl将溶液调整到pH7，用EA提取水层。混合有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥浓缩，得到化合物7；化合物7（1g，2.30mmol）的20mLMeOH溶液中加入100mgPd/C，室温下搅拌过夜。将混合物过滤并浓缩，得到白色固体化合物8即Pyr。（2）完全抗原的制备：免疫原Pyr-KLH的制备：称取半抗原Pyr，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解得到A液；取钥孔血蓝蛋白KLH，用硼酸缓冲溶液溶解得到B液；在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物Pyr-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原Pyr-KLH。提供制备所述吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：（1）小鼠的免疫：将免疫原Pyr-KLH与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用Pyr-KLH完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株；（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对吡哆醇具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为250ng/mL），为检测婴幼儿食品、乳品和特殊医学用途食品中吡哆醇含量提供了免疫学方法。本专利技术提供的吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测吡哆醇的试剂盒，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.14687，分类命名单克隆细胞株，保藏日期为2017年9月5日。附图说明图1是吡哆醇单克隆抗体对吡哆醇的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将吡哆醇完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14687，保藏日期为2017年9月5日。

【技术特征摘要】
1.一株吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14687，保藏日期为2017年9月5日。2.吡哆醇单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.14687，吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708分泌产生。3.权利要求2所述吡哆醇单克隆抗体的应用，其特征是：用于建立吡哆醇含量的免疫检测方法，应用于残留吡哆醇的检测中。4.根据权利要求3所述吡哆醇单克隆抗体的应用，其特征是：所述检测领域为婴幼儿食品、乳品或特殊医学用途食品中。5.用于制备权利要求1所述吡哆醇单克隆抗体杂交瘤细胞株SS0708的免疫原Pyr-KLH的制备方法，其特征是步骤如下：（1）半抗原Pyr的制备：a、将吡哆醇20g，118mmol溶解于200mL丙酮中，加入200mL2，2-二甲氧基丙烷和对甲苯磺酸81.4g，473mmol，130℃搅拌过夜；将反应混合物倒入冰水中冷却并用DCM提取水相，混合有机相并用盐水洗涤，Na2SO4干燥浓缩，用乙醚重结晶所得产物，将混合物过滤，得到白色固体化合物2；b、0℃氮气下，将NaH6.88g，287mmol，60%有机相的溶液加入到70mLTHF中，加入溶解在200mLTHF中的15g化合物2，71.7mmol；回流30min，冷却至室温后，加入苄基溴24.5g，143mmol，再次回流4h，然后用二氯甲烷萃取；收集有机提取物，用盐水洗涤，干燥浓缩，得到深棕色油状物，用硅胶柱纯化残留物，得到棕色油状化合物3；c、12g，40.1mmol化合物3的水溶液中加入24mL98%甲酸，50℃搅拌24h，然后用饱和NaHCO3溶液将其调节至pH7；中和后，用二氯甲烷多次萃取反应混合物，将有机萃取物干燥浓缩，得到深棕色固体，用快速色谱法纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，曾露，匡华，徐丽广，马伟，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32