一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术所述分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14702，保藏日期为2017年9月5日；所述菌株可以分泌产生抗左旋咪唑单克隆抗体。该单抗对左旋咪唑具有较好亲和力和较高灵敏度，对左旋咪唑的50%抑制浓度IC50为17.2μg/L，可用于制备左旋咪唑的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为动物源性食品中左旋咪唑的检测提供有力的检测方法及手段。

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
本专利技术涉及一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测

技术介绍
左旋咪唑是一种人工合成的广谱驱肠虫药，应用历史悠久，主要用于驱蛔虫和钩虫，曾经被世界卫生组织和我国卫生部等有关部门认定或推荐为治疗蛔虫病和钩虫病的药物。对多种动物的胃肠道线虫和肺线虫成虫及幼虫均有高效，在兽医临床上用于治疗蛔虫、钩虫、蛲虫、粪圆线虫和丝虫等感染。随着左旋咪唑应用范围的不断扩大，不良反应的报道不断增多，主要表现有消化系统毒副作用、神经系统毒副作用、心血管系统毒副作用、泌尿系统毒副作用等。因此，建立有效的左旋咪唑残留检测方法，对有效控制畜产品中左旋咪唑的残留，促进畜牧养殖业的健康发展，保障广大人民群众的身体健康，具有深远的意义。目前左旋咪唑检测多采用仪器检测方法，如高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述不足之处，提供一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对左旋咪唑具有较好的亲和力和灵敏度，可以用来建立左旋咪唑酶联免疫检测方法，或建立胶体金免疫层析试纸条快速检测方法。按照本专利技术提供的技术方案，一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14702，保藏日期为2017年9月5日。抗左旋咪唑单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.14702，分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506分泌产生。所述抗左旋咪唑单克隆抗体的应用，将其应用在食品安全中左旋咪唑残留的检测中。本专利技术提供的分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506的制备步骤为：（1）免疫原的制备与鉴定：以氨基左旋咪唑为原料，通过戊二醛法与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；（2）小鼠的免疫：选取6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫小鼠，首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG2000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株20170506；（4）杂交瘤细胞株20170506性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC50值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。本专利技术的有益效果：本专利技术获得的分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，分泌获得的抗左旋咪唑单克隆抗体对左旋咪唑有较好的检测灵敏度和亲和力，为左旋咪唑的检测提供了有效的方法。生物材料样品保藏：一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，所述杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.14702，保藏日期为2017年9月5日，分类命名为单克隆细胞株。附图说明图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。图2是左旋咪唑单克隆抗体的标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将左旋咪唑完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对左旋咪唑有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1：抗左旋咪唑单克隆抗体杂交瘤细胞株20170506的制备（1）完全抗原的合成：取2.2mg氨基左旋咪唑溶于2mL甲醇中，再加入1mL的1M盐酸溶液，冰浴条件下放置半个小时后，缓慢加入现配的1mg/mL的亚硝酸钠溶液进行活化反应，添加过程中以淀粉碘化钾试纸监控反应体系，当试纸变为蓝黑色时，停止加入亚硝酸钠溶液，活化半小时后，缓慢逐滴加入到5mL3mg/mL的BSA溶液中偶联，反应过夜，取出免疫原用PBS透析三天，-20℃分装保存。（2）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取左旋咪唑完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。（3）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为2000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；c、将脾细胞和SP2/0细胞按照2～10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用左旋咪唑为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对左旋咪唑有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得抗左旋咪唑单克隆抗体杂交瘤细胞株20170506。实施例2抗左旋咪唑单克隆抗体的制备与鉴定取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2a型，具体如表1所示。表1左旋咪唑单克隆抗体的亚型鉴定使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对左旋咪唑的IC50为17.2μg/L，并验证了其对他达拉非等的IC50及交叉反应率，具体如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14702，保藏日期为2017年9月5日。

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗左旋咪唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株20170506，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14702，保藏日期为2017年9月5日。2.抗左旋咪唑单克隆抗体，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，王忠兴，匡华，徐丽广，刘丽强，马伟，吴晓玲，宋珊珊，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，无锡迪腾敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32