一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法技术

本发明专利技术涉及分析技术领域，特别涉及一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法。该方法为将含有游离PEG的PEG修饰蛋白样品采用高效液相色谱进行分离，色谱条件为：色谱柱规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，

【技术实现步骤摘要】
一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法
本专利技术涉及分析
，特别涉及一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法。
技术介绍
蛋白质化学修饰的目的是用于生物医学和生物技术方面。在生物医学方面，化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、抑制免疫球蛋白E的产生等；在生物
，酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用，并表现出新颖的催化性能。由于聚乙二醇(PEG)溶解性好，毒性低，无免疫原性，蛋白质经其修饰后不但保持了水溶性而且在有机溶剂中的溶解性也增加，因此PEG类修饰剂应用最多。另外PEG修饰后的蛋白药物能提高稳定性和溶解性，延长蛋白药物的半衰期，减少免疫反应，具有较高的临床应用价值。目前，公知的检测PEG修饰蛋白中游离PEG的方法有SDS-PAGE碘染色法(杂志《化学通报》，2009年05期，聚乙二醇修饰蛋白体系的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法新探)、体积排阻液相色谱方法(杂志《药学研究》，2013，Vol32，No.11，PEG-EPO中游离PEG的示差折光率检测)、硅胶基质反相液相色谱方法(杂志《微生物学免疫学进展》，2007年第53卷第3期，PEG化重组人白细胞介素-6制品游离PEG测定方法的研究)等。SDS-PAGE碘染色法无法进行游离PEG的定量分析，同时显色胶片很快就会褪色；体积排阻液相色谱及硅胶基质反相液相色谱(C18、C4)方法分离度很难满足要求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法。该方法可有效分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG，并可定量分析。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法，将含有游离PEG的PEG修饰蛋白样品采用高效液相色谱进行分离，高效液相色谱的色谱条件为：以聚苯乙烯二乙烯基苯(PS/DVB)为基质的色谱柱作为检测用柱，色谱柱的规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，孔径；流动相A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；柱温为10～80℃；流速为0.2～1.2mL/min；样品进样量为8～12μL。作为优选，PEG修饰蛋白样品为采用含10mg/mL组氨酸、100mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液稀释后得到的待测溶液。作为优选，待测溶液中PEG修饰蛋白样品的浓度为5～15mg/mL。优选地，待测溶液中PEG修饰蛋白样品的浓度为10mg/mL。作为优选，流动相A相为经过超声脱气、0.45μm水系滤膜过滤所得的水溶液。作为优选，B相为经过超声脱气、0.45μm有机滤膜过滤所得的乙腈溶液。作为优选，超声脱气的时间为半小时，之后冷却至室温。作为优选，高效液相色谱采用流动相A相和B相进行梯度洗脱，梯度洗脱为：0～20min，50％B～72％B。作为优选，柱温为80℃。作为优选，流速为0.8mL/min。作为优选，蒸发光散射检测器漂移管温度为60～80℃，气体流速为1.2～1.8L/min。优选地，蒸发光散射检测器漂移管温度为70℃，气体流速为1.5L/min。作为优选，样品进样量为10μL。在本专利技术中，高效液相色谱方法还包括定量分析的步骤，定量分析为以游离PEG标准溶液为待测样品，采用上述高效液相色谱方法中的色谱条件进行检测，绘制标准曲线，得到PEG修饰蛋白样品中游离PEG的含量。本专利技术提供了一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法。该方法为将含有游离PEG的PEG修饰蛋白样品采用高效液相色谱进行分离，高效液相色谱的色谱条件为：以聚苯乙烯二乙烯基苯为基质的色谱柱作为检测用柱，色谱柱的规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，孔径；流动相A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；检测器为蒸发光散射检测器；柱温为10～80℃；流速为0.2～1.2mL/min；样品进样量为8～12μL。本专利技术具有的技术效果为：第一，本专利技术采用高效液相色谱分析法，联合蒸发光散射检测器，选用聚苯乙烯二乙烯基苯(PS/DVB)为基质的色谱柱，以含三氟乙酸的水和乙腈溶液为流动相，通过控制柱温、流速及检测器条件，调整梯度，能很好的分离PEG修饰蛋白中的游离PEG；第二，本专利技术采用高效液相色谱分析法，操作方便，简单快速，适合PEG修饰蛋白中游离PEG的高通量检测。附图说明图1示实施例1色谱图；图2示实施例2色谱图；图3示对比例1色谱图；图4示对比例2色谱图。具体实施方式本专利技术公开了一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术提供的一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦)；蒸发光散射检测器3300(奥泰)；ProteomixRP-500色谱柱(Sepax)；乙腈(色谱纯，萨劳)。所用水为超纯水。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1：1、高效液相色谱条件流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，梯度为0～20min，50％B～72％B；色谱柱为ProteomixRP-500色谱柱(Sepax)，规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，孔径；柱温80℃；流速0.8mL/min；蒸发光散射检测器的漂移管温度为70℃，气体流速为1.5L/min；2、流动相配制：精确移取三氟乙酸500μL至500mL纯水中，混合均匀，超声脱气，冷却至室温后，用0.45μm水系滤膜过滤后作为A相；精确移取三氟乙酸500μL至500mL色谱级乙腈中，混合均匀，超声脱气，冷却至室温后，用0.45μm有机系滤膜过滤后作为B相。3、溶液配制：PEG修饰蛋白样品用含10mg/mL组氨酸、100mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液稀释2倍得到待测溶液。4、测定：按照步骤1的色谱条件，分析步骤3的待测溶液，稀释后的PEG修饰蛋白样品进样10μL。结果见图1，保留时间12.413min的峰为游离PEG，与相邻峰的分离度为2.23。实施例2：1、高效液相色谱条件流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液，梯度为0～20min，50％B～72％B；色谱柱为ProteomixRP-500色谱柱(Sepax)，规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，孔径；柱温80℃；流速0.8mL/min；蒸发光散射检测器的漂移管温度为70℃，气体流速为1.5L/min；2、流动相配制：精确移取三氟乙酸500μL至500mL纯水中，混合均匀，超声脱气，冷却至室温后，用0.45μm水系滤膜过滤后作为A相；精确移取三氟乙酸500μL至500mL色谱级乙腈中，混合均匀，超声脱气，冷却至室温后，用0.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法，其特征在于，将含有游离PEG的PEG修饰蛋白样品采用高效液相色谱进行分离，所述高效液相色谱的色谱条件为：以聚苯乙烯二乙烯基苯为基质的色谱柱作为检测用柱，所述色谱柱的规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，

【技术特征摘要】
1.一种分离PEG修饰蛋白样品中游离PEG的高效液相色谱方法，其特征在于，将含有游离PEG的PEG修饰蛋白样品采用高效液相色谱进行分离，所述高效液相色谱的色谱条件为：以聚苯乙烯二乙烯基苯为基质的色谱柱作为检测用柱，所述色谱柱的规格为4.6mm内径×150mm长度，5μm粒径，孔径；流动相A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；检测器为蒸发光散射检测器；柱温为10～80℃；流速为0.2～1.2mL/min；样品进样量为8～12μL。2.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述PEG修饰蛋白样品为采用含10mg/mL组氨酸、100mM氯化钠的20mM柠檬酸缓冲液稀释后得到的待测溶液。3.根据权利要求2所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述待测溶液中PEG修饰蛋白样品的浓度为5～15mg/mL。4.根据权利要求1所述的高效液相色谱方法，其特征在于，所述流动相A相为经过超声脱气、0.45μm水系滤膜过滤所得的水溶液，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓盼，黄学英，
申请(专利权)人：苏州赛分科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32