一种抗虫基因T-DNA载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫基因T‑DNA载体的构建及其应用。本发明专利技术将一个复合启动子用于启动一个抗虫基因的表达，所述的复合启动子包含有花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子以及水稻肌动蛋白Actin1的内含子序列。所述的抗虫基因由Cry1Ab和Vip3A通过连接肽连接构成。本发明专利技术所述的重组载体构建完成后转入玉米，转基因玉米中抗虫蛋白的表达量显著提高。本发明专利技术的重组载体可用于制备抗虫植物细胞，所述植物包括玉米、水稻等。利用本发明专利技术的重组载体转化得到的转基因植物，可以高效杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等主要鳞翅目害虫。

【技术实现步骤摘要】
一种抗虫基因T-DNA载体及其应用(一)
本专利技术涉及一种抗虫基因T-DNA载体的构建及其应用。(二)
技术介绍
害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失，害虫的防治目前主要依靠使用化学农药，但是农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害，目前转基因抗虫玉米、棉花等已经大量推广种植。转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。比较常用的是BT杀虫晶体蛋白，如Cry1Ab、Cry1C等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物；近年来在BT中发现的另一种营养期杀虫蛋白也被证明具有较好的抗虫活性，如Vip3A等。单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄；同时，长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，还可能引起害虫抗性的产生和发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种高表达抗虫蛋白的重组载体的DNA序列及其构建方法，以及在获得转基因抗虫农作物中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种抗虫基因T-DNA载体，所述T-DNA载体包含了一个具有花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子以及水稻肌动蛋白Actin1内含子序列来启动抗虫基因表达的完整表达框，具体所述T-DNA载体包含抗虫基因表达框，所述抗虫基因表达框是由抗虫基因、复合启动子和终止子拼接构成；复合启动子由CaMV35s和Actin-intron拼接而成。进一步，所述的抗虫基因由Cry1Ab和Vip3A连接而成。进一步，所述抗虫基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列(SEQIDNO:1所示)与编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列(SEQIDNO:2所示)通过连接肽基因序列连接构成，完整的抗虫基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示。进一步，所述CaMV35s核苷酸序列为SEQIDNO:4所示，所述Actin-intron核苷酸序列为SEQIDNO:5所示。进一步，所述终止子为终止子Pepc-ter，核苷酸序列为SEQIDNO:6所示。本专利技术所述T-DNA核苷酸序列为SEQIDNO:7所示。本专利技术还涉及一种所述抗虫基因T-DNA载体在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为单子叶植物，优选为玉米或水稻。本行业的技术人员均知道以下理论：1)一种用于制备抗虫植物细胞的转化载体中必须包含整个抗虫基因的表达框，由启动子、基因、终止子三个组件构成；2)并非任意的启动子都能高效启动抗虫基因的表达，不同的启动子对于抗虫蛋白的表达效果相差很大。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：1)由CaMV35s与水稻肌动蛋白Actin1内含子序列拼接而成的复合启动子，可以高效启动抗虫基因的表达；2)将上述抗虫基因的表达框的T-DNA转入植物后，获得的转基因株系中抗虫蛋白的表达量能够显著提高。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology，和J.Sambrook等编写的ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdED.等文献均有详细的说明。实施例1、抗虫基因表达框的构建由上海生工人工合成抗虫基因Cry1Ab核苷酸序列为SEQIDNO:1，Vip3A核苷酸序列为SEQIDNO:2，Cry1Ab基因与Vip3A基因通过连接肽基因序列连接为一个完整的抗虫基因，该抗虫基因的序列为SEQIDNO:3。由上海生工人工合成启动子CaMV35S的核苷酸序列为SEQIDNO:4，编码水稻肌动蛋白的内含子Actin-intron核苷酸序列为SEQIDNO:5。抗虫基因的构建过程：Cry1Ab片段由BamHI和XmaI酶切获得，Vip3A片段由XmaI和SacI酶切获得。将上述两个片段以T4DNA聚合酶连接到中间载体中，得到一个两端的酶切位点为BamHI和SacI的完整的抗虫基因。启动子35S/Actin-intron的构建过程：CaMV35S片段由HindIII和XhoI酶切获得，Actin-intron片段由XhoI和BamHI酶切获得。将上述两个片段以T4DNA聚合酶连接到中间载体中，得到一个两端的酶切位点为HindIII和BamHI的完整的复合启动子。将上述完整的抗虫基因和完整的复合启动子分别酶切，连同终止子(玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的终止子Pepc-ter，序列为SEQIDNO:6)连接到转化载体pCambia1300-G10(Zhao,Q.,etal.(2014)"ExpressionofCry1AbandCry2Abbyapolycistronictransgenewithaself-cleavagepeptideinrice."PlosOne9(10):e110006.)中，得到用于制备植物抗虫细胞的转化载体pCam-1Ab-v3A，载体中T-DNA部分的序列为SEQIDNO:7。相同条件下，以水稻肌动蛋白启动子pOsActin1替换上述p35S/Actin-intron，其余均保持一致，作为对照组CK。所得的对照T-DNA载体用于转化制备植物抗虫细胞。实施例2、转基因玉米的获得玉米转化事件所用的方法是农杆菌介导方法，根据Frame等报道的方法和培养基配方(PlantPhysiol,2002,129:13-22)进行转化，具体步骤如下：取授粉后8～10天的Hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0～1.5mm)，将含有实施例1构建的T-DNA载体pCam-1Ab-v3A的农杆菌与未成熟胚共培育2～3天(22℃)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上挂(含200mg/L的timentin杀农杆菌)，28℃暗培养10～14天。将所有的愈伤组织转移到带有2.0mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。转移所有的组织到新鲜的筛选培养基上，28℃暗培养2～3周。随后转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10～14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10～14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，获得转基因玉米植株。同样条件下，用含对照组T-DNA载体的农杆菌转化玉米，获得对照转基因玉米植株。实施例3、转基因农作物抗虫能力的测定利用玉米螟和棉铃虫测定通过实施例2获得的10个转基因玉米系的抗虫活性。取实施例2获得的转基因玉米嫩叶饲喂一龄幼虫，每叶接虫10头，28℃暗培养5天后记录数据。新生玉米螟一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，全部100％死亡；新生棉铃虫一龄幼虫取食10个转基因玉米系后，有8个系的棉铃虫100％死亡，其他两个系的棉铃虫死亡率在60％～90％之间。同时，通过实施例2的方法，在玉米中转入对照组CK的T-DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗虫基因T‑DNA载体，其特征在于所述T‑DNA载体包含抗虫基因表达框，所述抗虫基因表达框由抗虫基因、复合启动子和终止子拼接构成；所述复合启动子由CaMV 35s和Actin‑intron拼接而成。

【技术特征摘要】
1.一种抗虫基因T-DNA载体，其特征在于所述T-DNA载体包含抗虫基因表达框，所述抗虫基因表达框由抗虫基因、复合启动子和终止子拼接构成；所述复合启动子由CaMV35s和Actin-intron拼接而成。2.如权利要求1所述抗虫基因T-DNA载体，其特征在于所述的抗虫基因由Cry1Ab和Vip3A连接而成。3.如权利要求2所述抗虫基因T-DNA载体，其特征在于所述Cry1Ab基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，Vip3A基因的核苷酸序列是SEQIDNO:2所示。4.如权利要求1所述抗虫基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：于小星，许超，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33