一种植株突变体的制备方法技术

本申请公开了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。本发明专利技术植株突变体的制备方法方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。

【技术实现步骤摘要】
一种植株突变体的制备方法
本专利技术涉及分子生物血植物不育突变体创制
，特别涉及一种植株突变体的制备方法。
技术介绍
雄性不育性是与作物杂种优势利用密切相关的重要性状。水稻是利用杂种优势最为成功的作物之一，也是迄今发现雄性不育多样性最为丰富的作物之一。雄性不育系成为杂种优势利用的最有效武器，其中三系”法是我国推广杂交水稻最早，也是最普遍的一种育种和制种方法，“三系法”主要是利用了核质互作雄性不育系统，完成了“恢复系”、“保持系”和“繁殖系”的三系配套。其中的不育是由细胞质的遗传物质和细胞核的遗传物质共同决定。而光温敏雄性不育系材料为基础的“两系法”，虽然它打破了恢保关系的限制，极大的提高了配组自由度，繁殖和配组程序也极大的简化，但育性的转换收环境温度和光照的影响，制种风险较大，这也是两系杂交育种无法大面积推广的原因。自1966年袁隆平先生报道隐性核不育水稻后，相继发现了许多不育材料。这类不育材料的共同特点是不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。针对这一问题，科学家们一直在研究利用分子设计方法，解决不育系繁殖的难题，也先后提出了一些解决方案。针对解决隐性核雄性不育材料的繁殖问题，1993年6月11日，PLANTGENETICSYSTEM公司(Albertsen)提出了一项PCT专利申请，该专利提出了一种技术思想：在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因、花粉失活(败育)基因以及用于筛选的标记基因，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，除了利用上述三套元件的思想可以实现不育系创制和繁殖以外，还可以通过在纯合的雄性不育植株中转入连锁的育性恢复基因和用于筛选的标记基因两套元件，由此也可以获得该雄性不育植株的保持系，并进一步繁殖不育系(Perez-Prat，2002)。这些报道提出了利用分子生物学技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的繁殖问题，为开展分子设计杂交育种提供了新的思想。以上分子设计育种的新思想基于的是水稻细胞核上一对控制育性的基因。当此基因发生突变后，成为无功能的基因后，水稻花粉发育形成的过程受阻，从而产生无活性或不产生花粉，最终表现为不育。因此，突变体的获取是后续基因改造的基础，如何获取育性基因突变的突变体成为制约此项工作的关键点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种植株突变体的制备方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其序列结构如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种如所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。所述步骤T2中用到的培养基包括：筛选培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；Hyg20-25mg/L，Timentin200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；分化培养基：NB；Pro0.3-0.5g/L；CH0.2-0.3g/L；6-BA1.8-2.0mg/mL；KT0.8-1.0mg/mL；NAA0.3-0.5mg/mL，IAA0.4-0.5mg/mL；Hyg20-25mg/L；Timentin200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；生根培养基：NB；NAA0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：含有CYP78A13基因敲除载体质粒的农杆菌在28℃固体YEB培养基上暗培养2天后，用适量100μM/L乙酰丁香酮的培养基将农杆菌洗脱；调整菌液浓度至OD600nm＝0.1-1.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液；取经预培养的愈伤组织于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃中暗培养3天。所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：3天后，挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体用含250mg/L羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干；第二天转移至选择培养基筛选抗性愈伤。所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：每两周将愈伤转移至新的选择培养基上，18-24天可见瘤状抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出；抗性愈伤继续继代于附加潮霉素50mg/l的选择培养基中，观察其色泽，一周后将颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基上，无光泽，颜色暗淡的愈伤则淘汰掉。所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：待抗性愈伤在筛选培养基上筛选3-5d后，挑选部分转移至分化培养基上；二周后抗性愈伤出现绿芽，3周后长出幼芽，随后根也长出；将幼苗移至生根培养基上；待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至大田栽种。所述步骤T4.转基因植株表型鉴定，进一步包括：花粉活力检测：转基因阳性植株花粉活性丧失；从株型上看，转基因植株呈现植株营养生长延长，抽穗慢或抽穗不彻底。本专利技术有益效果包括：提供了一种植株突变体的制备方法，以水稻细胞核育性基因作为目标基因，利用CRISPR/cas9基因沉默进行基因敲除，基因沉默后丧失功能，细胞发育长成完整植株，但不具备发育成正常功能的花粉，并能够以此为研究对象，用于创制不育系。附图说明图1为本专利技术实施例所述花粉活力检测结果；其中，左图是对照植株，右图是转基因植株；图2为本专利技术实施例所述育性表现图；其中，左图为对照植株；右图是CYP78A13基因被敲除的植株。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种植株突变体的制备方法，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。为解决上述技术问题，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植株突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种植株突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因；T2.农杆菌转化；T3.基因敲除检测；T4.转基因植株表型鉴定。2.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T1.构建CRISPR/cas9基因敲除载体，敲除CYP78A13基因中，sgRNA序列如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。3.一种敲除基因中使用的sgRNA序列，其特征在于，其序列结构如下：5’-ggcaCACAATGGCTCCAGCATTCC-3’5’-AAACGGAATGCTGGAGCCATTGTG-3’。4.一种如权利要求3所述敲除基因中使用的sgRNA序列，在构建基因敲除载体中的应用。5.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2中用到的培养基包括：筛选培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；Hyg20-25mg/L，Timentin200-400mg/L，琼脂粉10-15g/L；分化培养基：NB；Pro0.3-0.5g/L；CH0.2-0.3g/L；6-BA1.8-2.0mg/mL；KT0.8-1.0mg/mL；NAA0.3-0.5mg/mL，IAA0.4-0.5mg/mL；Hyg20-25mg/L；Timentin200-400mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L；生根培养基：NB；NAA0.4-0.7mg/L；蔗糖25-30g/L；琼脂粉10-15g/L。6.根据权利要求1所述植株突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤T2.农杆菌转化，进一步包括：含...

【专利技术属性】
技术研发人员：米铁柱，张国栋，刘佳音，万吉丽，王克响，罗碧，
申请(专利权)人：青岛袁策集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37