先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法技术

本申请公开了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300‑hpt‑质粒的连接。进一步包括：构建双T‑DNA载体，其中一个T‑DNA区含有三连锁基因，另一个T‑DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。本发明专利技术提供了一种基于DsRED荧光蛋白基因为报告基因的不含潮霉素抗性基因的工程菌株。本发明专利技术还提供了一种将片段进行融合，然后转化载体的一种实验新思路。

Construction of vectors by fusing fragments and transforming them into vectors

This application discloses a method for constructing a vector by fusing fragments and then transforming them into vectors, including the following steps: A, extracting the DNA of the plant to be transformed; B, obtaining multiple linkage gene expression boxes; C, obtaining the pCAMBIA1300 plasmid that removes the Hpt gene; D, the connection of each expression boxes; E, the connection of fusion fragments with pCAMBIA1300 HPT plasmid. Further, we constructed a double T_DNA vector, in which one T_DNA region contains three linked genes and the other T_DNA region contains resistance genes for screening callus transformation and plant regeneration stages. The three linked genes are DsRed gene, EAT1 gene and ZmAA gene, respectively. The invention provides an engineering strain without hygromycin resistance gene based on DsRED fluorescent protein gene as a reporter gene. The invention also provides an experimental new idea of fusing fragments and then transforming carriers.

【技术实现步骤摘要】
先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法
本专利技术涉及基因工程遗传育种学和生物遗传改良
，特别涉及一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法。
技术介绍
水稻作为世界上超过一半人口的主食，是最重要的粮食作物之一.在过去的半个多世纪里，水稻育种取得了巨大的成功。水稻的单位产量实现了倍增，部分地方甚至提高至3倍，这为保障世界粮食安全作出了巨大的贡献.但近十几年来水稻的产量停滞不前，这一方面是由于在育种技术上没有新的突破以及遗传多样性在栽培品种中的逐步变窄，另一方面也是因为频繁发生的病虫害以及旱灾等自然灾害使得水稻生产损失惨重。然而，世界人口的持续增长以及社会经济的快速发展导致对粮食的需求不断增加。针对这些问题，我国学者提出了培育绿色超级稻的设想，围绕水稻抗病虫、抗旱、营养高效利用、优质、高产等五大重要性状，对水稻品种进行全面改良以实现农业的可持续发展。而转基因技术作为一种新兴的育种手段，在实现绿色超级稻目标上将发挥重要作用.水稻的转基因研究始于20世纪80年代末期，迄今已有大量的转基因水稻研究被报道。水稻转基因技术始于原生质体培养，1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株；1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株；1990年从籼稻品种ChinsurahBoroII中获得第一例转基因籼稻植株；1990年李宝健等用农杆菌感染水稻组织获得转化愈伤组织；1991年利用水稻幼胚作为受体材料，用基因枪法，成功获得转基因植株，并且转化效率明显提高。从此，幼胚作为转基因受体材料得到广泛研究应用。1993年用农杆菌法在粳稻品种上获得了转基因植株，此后，基因枪轰击法和农杆菌介导法作为最有价值的转化途径广泛用于水稻转基因研究。根据第三代不育系的原理，我们最终拿到的不育系不含有任何转基因元件，而得到的保持系则仅含有：筛选标记基因-花粉致死基因-育性恢复基因三个基因，其中筛选标记基因是红色荧光蛋白(DsRed)，来自礁珊瑚(Discosomasp.)，利用种子特异表达的启动子使DsRed基因在种子种特异表达来筛选不育系的种子；花粉致死基因是玉米α淀粉酶基因(ZmAA1)，来自玉米，可使携带该基因的花粉粒败育；育性恢复基因在水稻中一般是普通隐性核不育基因，来自水稻本身，可使相应基因突变体株系恢复育性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法。本发方法将潮霉素抗性基因与红色荧光基因(DsRed)基因进行连锁后转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在愈伤组织细胞培养筛选阶段加入潮霉素，同时结合红色荧光检测，快速、有效的筛选。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300-hpt-质粒的连接。所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，进一步包括：构建双T-DNA载体，其中一个T-DNA区含有三连锁基因，另一个T-DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。构建含有EAT1基因的T-DNA区的方法包括：以步骤A获得的DNA为模板，以EAT1-F：CGATCGtcctattaEAT1-R：GTTTAAACacaat为引物扩增水稻EAT1基因表达盒。构建含有DsRed基因的T-DNA区的方法包括：以含有DsRED片段的pGDR质粒为模板，利用DsRed-F：gagatccactagttctagag/DsRed-R：tgtgttttgcgaatgcggcc引物扩增获得DsRED基因表达盒，构建含有ZmAA基因的T-DNA区的方法包括：以玉米DNA为模板，以ZmAA-F：gacctgcaggcatgcaagct/ZmAA-R：tctttcccctatatctccacg为引物扩增得到基因ZmAA1基因表达盒。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种在构建含有EAT1基因的T-DNA区的载体中使用的引物，引物序列为：EAT1-F：CGATCGtcctattaEAT1-R：GTTTAAACacaat为解决上述技术问题，本专利技术又提供了一种在构建含有DsRed基因的T-DNA区的载体中使用的引物，引物序列为：DsRed-F：gagatccactagttctagag/DsRed-R：tgtgttttgcgaatgcggcc为解决上述技术问题，本专利技术另提供了一种在构建含有ZmAA基因的T-DNA区的载体中使用的引物，引物序列为：ZmAA-F：gacctgcaggcatgcaagctZmAA-R：tctttcccctatatctccacg为解决上述技术问题，本专利技术再提供了一种如权利要求前述任一项引物在载体构建和或工程菌株构建中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种如前述任一项所述构建方法构建的载体。本专利技术有益效果包括：本专利技术先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，构建了双T-DNA载体，其中一个T-DNA区含有上述的三连锁基因，另一个T-DNA区含有潮霉素或者卡那霉素等抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选。附图说明图1为本专利技术实施例所述去除Hyg抗性基因后的pCAMBIA1300质粒图谱；图2为本专利技术实施例所述DsRED表达盒电泳检测图；图3为本专利技术实施例所述EAT1表达盒电泳检测图；图4为本专利技术实施例所述ZMAA1表达盒电泳检测。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。本专利技术将潮霉素抗性基因与红色荧光基因(DsRed)基因进行连锁后转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织，在愈伤组织细胞培养筛选阶段加入潮霉素，同时结合红色荧光检测，快速、有效的的筛选。在本专利技术一实施例中，提供了一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300-hpt-质粒的连接。所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，进一步包括：构建双T-DNA载体，其中一个T-DNA区含有三连锁基因，另一个T-DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。构建含有EAT1基因的T-DNA区的方法包括：以步骤A获得的DNA为模板，以EAT1-F：CGATCGtcctattaEAT1-R：GTTTAAACacaat为引物扩增水稻EAT1基因表达盒。构建含有DsRed基因的T-DNA区的方法包括：以含有DsRED片段的pGDR质粒为模板，利用DsRed-F：gagatccactagttctagag/DsRed-R：tgtgttttgcgaatgcggcc引物扩增获得DsRED基因表达盒，构建含有ZmAA基因的T-DNA区的方法包括：以玉米DNA为模板，以ZmAA-F：g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300‑hpt‑质粒的连接。

【技术特征摘要】
1.一种先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A、提取待转化作物DNA；B、分别获得多种连锁基因表达盒；C、获取去除Hpt基因的pCAMBIA1300质粒的；D、各个表达盒的连接；E、融合片段与pCAMBIA1300-hpt-质粒的连接。2.根据权利要求1所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，进一步包括：构建双T-DNA载体，其中一个T-DNA区含有三连锁基因，另一个T-DNA区含有抗性基因，用于愈伤转化及植株再生阶段的筛选；所述三连锁基因分别为：DsRed基因、EAT1基因、ZmAA基因。3.根据权利要求2所述先将片段进行融合然后转化构成载体的构建方法，其特征在于，构建含有EAT1基因的T-DNA区的方法包括：以步骤A获得的DNA为模板，以为引物扩增水稻EAT1基因表达盒。4.根据权利要求2所述先...

【专利技术属性】
技术研发人员：米铁柱，张国栋，刘佳音，邹丹丹，徐春莹，罗碧，刘洋，
申请(专利权)人：青岛袁策集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37