【技术实现步骤摘要】
一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转AaADS基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转AaADS基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。
技术介绍
青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗的最理想药物，能有效治疗对传统药物氯奎产生抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中直接提取，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟一药源。虽然黄花蒿系世界广泛分布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证明黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的0.8％—1.4％，因而使其分离成本高、产量低、废弃物多。野生黄花蒿中青蒿素含量很低，主要集中在0.1％—0.60％之间，高者也仅为0.8％左右。通过杂交和定向育种开展了大量提高黄花蒿中青蒿素含量的尝试，但目前报道的最高青蒿素含量也未超过1.4％，说...
【技术保护点】
1.一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转AaADS基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)在黄花蒿腺毛细胞过表达基因的载体重组构建：将青蒿素合成关键基因构建到Ti质粒的T‑DNA区，以HPT基因为选择标记基因，以pCAMBIA1301作为出发载体进行改造和载体构建；得到重组Ti质粒pCAMBIA1301‑AaADSpro::AaADS，所述重组Ti质粒的序列如SEQ ID NO.1所示；(2)工程化根癌农杆菌的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌，培养工程农杆菌至对数生长后期...
【技术特征摘要】
1.一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转AaADS基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)在黄花蒿腺毛细胞过表达基因的载体重组构建：将青蒿素合成关键基因构建到Ti质粒的T-DNA区，以HPT基因为选择标记基因，以pCAMBIA1301作为出发载体进行改造和载体构建；得到重组Ti质粒pCAMBIA1301-AaADSpro::AaADS，所述重组Ti质粒的序列如SEQIDNO.1所示；(2)工程化根癌农杆菌的制备：构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌，培养工程农杆菌至对数生长后期；(3)黄花蒿悬浮细胞系的建立：将深绿色或淡黄色生长快、结构疏松颗粒状的黄花蒿愈伤组织置于MS液体培养基中，将愈伤轻轻夹碎，摇床150r/min，光照周期为16h/8h光暗交替，温度为25±2℃振荡培养；培养15—20d为悬浮细胞的快速增长且细胞活性较高期，选取该时期的直径在5mm以内的小细胞团及含有单细胞的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液，备用；(4)黄花蒿悬浮细胞的共培浸染转化：将步骤(3)所得的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液与步骤(2)中生长至对数生长后期的工程农杆菌共培2.5—3.5d，然后转入筛选培养基上培养；(5)转化细胞的筛选和获得抗性愈伤组织：经步骤(4)共培2.5—3.5d后的黄花蒿悬浮细胞经MS液体培养基冲洗后，置于含200mg/L羧苄青霉素和30mg/LHPT抗性的诱导愈伤及丛生芽分化的培养基上，培养至愈伤上有丛生芽的分化(6周左右)，获得抗性丛生芽并继代增殖；(6)诱导根分化和获得转基因植株：当抗性丛生芽生长至3—5cm大小时，将抗性丛生芽转移到生根培养基诱导根分化，分化后幼苗经过炼苗后移栽至营养基质中，获得转基因植株；(7)转基因植株的分子检测和腺毛细胞发育观察：提取转基因植株叶片的DNA，用PCR法进行目的基因的分子检测验证，通过体视荧光显微镜观察转基因植株叶片腺毛细胞的密度、大小及荧光强度，通过与对照的比较判断腺毛的发育情况，对腺毛发育具有显著促进的植株进行青...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵燕，龙炎杏，张学文，肖楠，罗莎，谢心，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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