柑橘显性功能突变体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括：步骤一、利用第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因连接入该载体骨架转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选得到阳性转化子；步骤三、将阳性转化子培养成植株之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。本发明专利技术创制出当代即可利用的柑橘遗传材料，解决了当前无法利用T‑DNA插入方法快速创制出直接可以利用的柑橘突变体的问题。

【技术实现步骤摘要】
柑橘显性功能突变体的制备方法
本专利技术属于生物技术研发
，涉及一种柑橘显性功能突变体的制备方法。
技术介绍
T-DNA序列插入植物基因组后，能破坏插入位点基因的转录。将有T-DNA序列插入的植株通过自交回交等方法能在其子代中获得该基因T-DNA插入纯合的株系，即能获得到该基因功能缺失的突变体。利用获得的T-DNA插入纯合突变体与野生型等植物材料在不同生长条件下进行表型检测，已成为发掘鉴定拟南芥、水稻等植物功能基因的重要手段。但，柑橘的童期长，从种子生长成实生植株结出果实一般需要至少5年以上，因此柑橘不容易通过自交回交等方法快速获得相关基因插入纯合的植物材料，这也是至今无法利用大规模构建柑橘T-DNA插入突变群体的方法来发掘鉴定柑橘农艺性状功能基因的重要原因。在T-DNA内的边界处安装组成型强启动子能对插入位点附近基因的表达产生影响。当边界处含强启动子的T-DNA插入植物基因组中时，既可能干扰插入位点处基因的正常表达(RNAi)，产生该基因沉默的功能缺失性突变体，也可能导致插入位点附近处基因过量表达，产生基因过量表达的功能获得性突变体。这些显性的功能突变体无需进行自交杂交等纯化过程，当代的株系即可与其他植物材料进行表型比较来发掘鉴定植物性状功能基因，这比利用纯合T-DNA插入基因敲除突变体来鉴定基因功能的方法至少可节约繁育该植物1代的时间。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种柑橘显性功能突变体的制备方法。为此，本专利技术提供的技术方案为：一种柑橘显性功能突变体的制备方法，包括如下步骤：步骤一、利用如SEQIDNO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架(pCAMBIA1300质粒来自于湖南省园艺研究所实验室；PCR的反应体系(30μL)：10×PCR缓冲液3μL，dNTPs(each2.5mmol/L)1μL，正向引物(10μmol/L)0.5μL，反向引物(10μmol/L)0.5μL，PyrobestDNA聚合酶(5U/μL)1μL，模板(0.2μg/L)1μL，无菌去离子水23μL；扩增条件：95℃5min；95℃20s，55℃20s，72℃6min，25个循环；72℃10min)，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将目标序列整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；步骤三、将所述阳性转化子培养形成完整植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因；利用如SEQIDNO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述第一强启动子为NOSp启动子；利用如SEQIDNO：5和6所示的第三对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述NOSp启动子基因的产物。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，所述第二强启动子为CaMV35S启动子；利用如SEQIDNO：7和8所示的第四对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述CaMV35S启动子基因的产物。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤一中，构建含有转移DNA结构域的所述目的载体的具体步骤包括：1.1)利用限制性内切酶SalⅠ对含有转移DNA结构域的所述载体骨架序列扩增产物进行酶切，然后使其发生自连接反应，获得pVC质粒；1.2)首先利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp启动子基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒，之后分别取双酶切后的NOSp启动子基因扩增产物和双酶切后的pVC质粒产物进行连接，获得pVC-NOSp质粒；1.3)首先利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUS基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒，之后分别取双酶切后的GUS基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSp质粒产物进行连接，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒；1.4)首先利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件CaMV35S基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒，之后分别取双酶切的CaMV35S基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSpGUSter质粒产物进行连接，获得所述目的载体pVC-NOSpGUSter-35S载体质粒。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤二中，将所述目的载体通过农杆菌介导的转化法整合到柑橘幼苗基因组的具体方法包括：2.1)首先将所述目的载体(pVC-NOSpGUSter-35S)转化入农杆菌感受态EHA105细胞中，获得含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，然后培养含有目的载体的农杆菌EHA105宿主细胞，并制备农杆菌转化液；2.2)首先在无菌条件下，横截切取柑橘幼苗植株的节间茎段，每个节间茎段茎粗为1mm-3mm、长度为1cm-2cm，然后将各节间茎段浸泡于装有上述农杆菌转化液的三角瓶中，再然后将三角瓶置于真空抽气装置中，室温条件下维持真空抽气装置中气压为0.01～0.03MPa，保持10～20min，然后缓慢解除低气压状态，以三角瓶内的农杆菌转化液液面不出现晃动为宜，直至真空抽气装置内恢复到正常大气压；2.3)在无菌条件下，将经过转化处理后的节间茎段置于生芽培养基上培养至生长出再生芽；2.4)剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法鉴定得到所述阳性转化子。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，步骤2.4)中，还可采用PCR扩增方法进行阳性转化子的鉴定，PCR扩增方法采用的引物为如SEQIDNO：3和4所示的第二对引物对、如SEQIDNO：5和6所示的第三对引物对或如SEQIDNO：7和8所示的第四对引物对。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，所述步骤三中，将所述阳性转化子培养形成完整植株的具体方法包括如下步骤：在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽，将再生芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处，该纵切处的深度约0.2cm；然后将制备的试管嫁接苗于光周期条件12h光照/12h黑暗、生长温度在26-28℃下培养15天以上，形成所述完整植株。优选的是，所述的柑橘显性功能突变体的制备方法中，步骤2.4)中，利用GUS染色方法鉴定得到阳性转化子的具体方法包括如下步骤：将再生芽的部分叶片浸入GUS染色液中于37℃黑暗孵育24h进行染色，染色结束后先用浓度为0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗叶片，然后用含2％的甲醛(体积百分比浓度)和0.5％戊二醛(体积百分比浓度)的0.1mol/L磷酸缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、利用如SEQ ID NO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将含有目标序列的转移DNA结构域整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；步骤三、将所述阳性转化子培养成植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。

【技术特征摘要】
1.一种柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、利用如SEQIDNO：1和2所示的第一对引物对，以pCAMBIA1300载体为模板，扩增得到含有转移DNA结构域的载体骨架，之后将第一强启动子基因、报告基因和第二强启动子基因均连接入该载体骨架的转移DNA结构域的左右两边界之间，构建获得转移DNA结构域含有目标序列的目的载体，其中，第一强启动子位于报告基因的上游，第二强启动子位于报告基因的下游；步骤二、通过农杆菌介导的转化法将含有目标序列的转移DNA结构域整合到柑橘幼苗基因组上，筛选以得到含有报告基因的阳性转化子；步骤三、将所述阳性转化子培养成植株，之后定植在土壤中或嫁接到砧木上保存，得到柑橘显性功能突变体。2.如权利要求1所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述报告基因采用GUS基因；利用如SEQIDNO：3和4所示的第二对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述GUS基因的产物。3.如权利要求1或2任一项所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一强启动子为NOSp启动子；利用如SEQIDNO：5和6所示的第三对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述NOSp启动子基因的产物。4.如权利要求3所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第二强启动子为CaMV35S启动子；利用如SEQIDNO：7和8所示的第四对引物对，以pBI121载体为模板，扩增得到含有所述CaMV35S启动子基因的产物。5.如权利要求4所述的柑橘显性功能突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，构建含有转移DNA结构域的所述目的载体的具体步骤包括：1.1)利用限制性内切酶SalⅠ对含有转移DNA结构域的所述载体骨架序列扩增产物进行酶切，然后使其发生自连接反应，获得pVC质粒；1.2)首先利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切载体元件NOSp启动子基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ双酶切pVC质粒，之后分别取双酶切后的NOSp启动子基因扩增产物和双酶切后的pVC质粒产物进行连接，获得pVC-NOSp质粒；1.3)首先利用限制性内切酶XhoⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件GUS基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSp质粒，之后分别取双酶切后的GUS基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSp质粒产物进行连接，获得pVC-NOSpGUSter载体质粒；1.4)首先利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切载体元件CaMV35S基因的扩增产物，同时利用限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切pVC-NOSpGUSter质粒，之后分别取双酶切后的CaMV35S基因扩增产物和双酶切后的pVC-NOSpGUSter质粒产物进行连接，获得所述目的载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔佑涵，李卫东，李先信，吴娟娟，苑平，张平，
申请(专利权)人：湖南省园艺研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43