本发明专利技术公开了一种重组表达载体及其在增加水稻产量和降低镉浓度上应用，该重组表达载体含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsAMT1.1，所述水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，水稻基因OsAMT1.1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术的重组表达载体能显著提高水稻的生长，增加水稻的籽粒产量，降低水稻籽粒中镉浓度。
【技术实现步骤摘要】
重组表达载体及其在增加水稻产量和降低镉浓度上应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种含水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsAMT1.1的重组表达载体及其应用。
技术介绍
氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中很多生命物质的组成成分，比如：氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干重的1.5－2％和植物总蛋白的16％(FrinkCR.,WaggonerPE.andAusubelJH.Nitrogenfertilizer:retrospectandprospect.Proc.Nati.Acad.Sci.USA.1999.96:1175～1180.)。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30％(彭少兵,黄见良,钟旭华,杨建昌,王光火,邹应斌,张福锁,朱庆森,RolandBuresh,ChristianWitt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002,35(9):1095～1103.)，成为世界第一大消费国。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70％。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。镉被认为是强致癌物质，它在人体的潜伏可以长达10-30年，甚至影响下一代的健康。近些年，市场上出现了大量的“镉米”，“镉米”之所以出现，一个重要的原因就是随着工业化的迅猛发展，含“镉”等重金属的污染物通过各种途径进入水稻生产区的土壤，造成大米重金属严重超标等现象(ClemensS.,AartsMGM.,ThomineS.,VerbruggenN.Plantscience:Thekeytopreventingslowcadmiumpoisoning.TrendsPlantSci.2013.18:92–99；SebastianA.,PrasadMNV.Cadmiumminimizationinrice.Areview.Agron.Sustain.Dev.2014.34:155–173)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种重组表达载体，提高水稻产量。本专利技术的技术方案为：一种重组表达载体，含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsAMT1.1，所述水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，水稻基因OsAMT1.1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。进一步地，重组表达载体中载体为pTCK303质粒载体。进一步地，重组表达载体中含有增强子或报告基因。进一步地，增强子为转录增强子或翻译增强子。进一步地，报告基因为抗生素抗性基因、GUS报告基因或荧光素酶报告基因。本专利技术的重组表达载体在提高水稻的生长或/和提高水稻产量或/和降低水稻镉浓度上的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、通过系统研究，首次公开了日本晴水稻转水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsAMT1.1可以增加水稻苗期的生物量，与对照相比，转基因株系的根重和地上部干重分别增加了约42.1％和38.6％。2、本专利技术的水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsAMT1.1的转基因植株，与对照相比，转基因水稻的总分蘖、有效分蘖、穗长、单穗重、结实率和单株穗重都显著增加，转基因水稻田间产量增加18.3％-22.7％，总生物量增加19.2％-21.2％。3、本专利技术首次公开了日本晴水稻转水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsAMT1.1可以减少水稻中各个部位镉的浓度，其中糙米中镉的浓度减少约47.6％附图说明图1：水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsAMT1.1载体示意图。图2：苗期水培条件下转基因株系的生长表型；a：水培四周时的生长表型。b：转基因株系OsAMT1.1的表达鉴定。c：转基因株系地上和地下部生物量统计。图3：转基因株系T2代的产量统计；a：收获期的生长表型。b：转基因株系产量和生物量统计。图4：转基因株系T3代的产量统计；a：收获期的生长表型。b：转基因株系产量和生物量统计。图5：转基因株系各个部位镉浓度分析。具体实施方式一、水稻基因OsNAR2.1启动子序列的克隆1)水稻基因组DNA的提取水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，称取0.1g左右叶片，用液氮研碎，研磨充分加入2ml离心管，迅速加入1mlDNA提取液(购自TIANGEN,中国)，充分摇匀振荡后，抽提水稻基因组DNA。2)OsNAR2.1基因全长的克隆通过NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因数据库中检索到水稻的OsNAR2.1(AP004023.2)基因的启动子，用软件Primer5.0设计引物序列(如下)，从水稻基因组DNA中扩增NAR2.1基因的启动子序列。P1:5’-TGCTGACAAACCAAACCGACT-3’(SEQIDNo.3)P2:5’-CCCCACCTCTCCCACCTCAC-3’(SEQIDNo.4)以步骤1)获得的水稻基因组DNA为模板，用高保真酶(PrimeStarHSDNApolymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻基因OsNAR2.1的启动子序列(SEQIDNo.1)。二、水稻基因OsAMT1.1序列的克隆1)总RNA的提取水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，用0.2mM硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1mlTrizol试剂(购自Invitrogen,USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。2)OsAMT1.1基因全长的克隆利用水稻基因组注释计划网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的基因数据库中检索到水稻的OsAMT1.1基因序列OsAMT1.1(LOC_Os04g43070)。设计引物(如下)从组织cDNA库中钓出OsAMT1.1的全长序列。P3:5’-ATGGCGACGTGCGCGGCGGACC-3’(SEQIDNo.5)P4:5’-TTACACTTGGTTGTTGCTGTTG-3’(SEQIDNo.6)以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(PrimeStarHSDNApolymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温。琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-18载体(购自Takara公司)，测序正确后就获得具有完整编码区的水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsAMT1.1的全长序列(SEQIDNo.2)。三、表达水稻基因OsNAR2.1启动子启动水稻基因OsAMT1.1转基因株系的获得1)水稻基因OsNAR2.1启动子启动OsAMT1.11载体的构建根据步骤一中获得的水稻基因Os本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组表达载体，含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsAMT1.1，所述水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，水稻基因OsAMT1.1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，含有水稻基因OsNAR2.1的启动子和水稻基因OsAMT1.1，所述水稻基因OsNAR2.1的启动子核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，水稻基因OsAMT1.1的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2.根据权利要求1所述的一种重组表达载体，其特征在于，重组表达载体中载体为pTCK303质粒载体。3.根据权利要求1所述的一种重组表达载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈景光，李畅，孟丽君，叶国友，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。