抗GFAP蛋白单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.15598)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab129。本发明专利技术还涉及单克隆抗体Umab129在制备用于检测GFAP蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab129的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab129在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本发明专利技术所述单克隆抗体可与GFAP蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GFAP蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】
抗GFAP蛋白单克隆抗体及其用途
本专利技术涉及生物
，具体涉及可特异结合GFAP蛋白的单克隆抗体Umab129、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。
技术介绍
GFAP即胶质纤维酸性蛋白，是III型中间丝蛋白。GFAP和波形纤维蛋白形成星形胶质细胞中的中间纤丝，并且调节其运动性和形状。具体而言，波形纤维蛋白纤丝在发育早期阶段存在，而GFAP纤丝是分化和成熟的脑星形细胞的特征。GFAP常用作源自星形细胞的颅内和椎管内肿瘤的标记物，GFAP中间纤维也存在于周围神经系统内非髓鞘形成的雪旺氏细胞中。目前临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对GFAP蛋白的单克隆抗体对IHC检测GFAP表达水平具有重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种结合特异性较高的GFAP蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测GFAP蛋白的免疫检测工具中的应用。本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2018年4月26日，保藏编号为CGMCCNo.15598。本专利技术还提供了一种特异性结合GFAP蛋白的单克隆抗体Umab129，由上述杂交瘤细胞株产生。本专利技术所述单克隆抗体的制备方法如下：(1)重组表达载体的构建：根据GFAPORF核苷酸序列(GFAPORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，1299bp；GFAP氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物PCR扩增GFAPORF第1bp位到第1299bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pCMV6-Entry，构建GFAP氨基酸序列第1位到第432位的重组表达质粒pCMV6-rGFAP；上游扩增引物序列，SEQIDNO.3:CACGCGATCGCATGGAGAGGAGACGCATCACC下游扩增引物序列SEQIDNO.4:ACCGACGCGTCATCACATCCTTGTGCTCCTG(2)GFAP重组蛋白的表达与纯化：将GFAP重组表达质粒转化HEK293T细胞，裂解离心获得上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的GFAP重组蛋白；(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的GFAP重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗GFAP特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为Umab129，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得GFAP单克隆抗体Umab129。分别通过WesternBlot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。本专利技术还提供了单克隆抗体Umab129在制备用于检测GFAP蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本专利技术提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体Umab129，可检测组织细胞中GFAP的表达状况。本专利技术还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与GFAP的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于星形胶质细胞瘤。与现有技术相比，本专利技术提供了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCCNo.15598)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体Umab129。本专利技术还提供了单克隆抗体Umab129在制备用于检测GFAP蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体Umab129的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体Umab129在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。本专利技术所述单克隆抗体可与GFAP蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了GFAP蛋白免疫检测的特异性、准确性和可靠性，真实反映肿瘤细胞内GFAP蛋白表达水平，可应用于星形胶质细胞瘤等肿瘤组织中GFAP的表达水平。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株Umab129的分类命名为：GFAP鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称：CGMCC；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年4月26日；保藏编号：CGMCCNo.15598。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1克隆位点设计图，其中底纹部分为ORF区；图2示实施例2重组GFAP蛋白Westernblot检测结果图，以anti-DDK抗体检测重组GFAP蛋白在HEK293T细胞中的表达，其中左侧泳道为转染空载体的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果、右侧泳道为转染pCMV6-rGFAP质粒的HEK293T细胞裂解液为抗原的检测结果；图3示实施例2重组GFAP蛋白SDS-PAGE结果图，用抗DDK亲和层析柱纯化重组GFAP蛋白，纯化后的蛋白通过SDS-PAGE胶电脉、考马斯亮蓝染色；图4示实施例3以单克隆抗体Umab129识别完整的GFAP(FulllengthGFAP,GFAP-FL)蛋白的Westernblot检测结果图。泳道1为转染pCMV6-Entry的细胞裂解液；泳道2为转染pCMV6-GFAP-FL的细胞裂解液；图5示实施例3以单克隆抗体Umab129识别SNB19人胶质母细胞瘤细胞中内源GFAP蛋白的Westernblot检测结果图。图6示实施例3以单克隆抗体Umab129识别10种不同的人组织裂解液中内源GFAP蛋白的Westernblot检测结果图。从左到右依次为1：睾丸，2：网膜，3：子宫，4：乳腺，5：脑，6：肝，7：卵巢，8：结肠，9：脾，10：甲状腺。图7示实施例3以单克隆抗体Umab129识别小鼠脑组织裂解液中内源GFAP蛋白的Westernblot检测结果图。图8示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的成人脑组织免疫组化结果图(一抗为GFAP单克隆抗体Umab129)；图9示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胚胎大脑皮层组织免疫组化结果图(一抗为GFAP单克隆抗体Umab129)；图10示实施例4福尔马林固定、石蜡包埋的人胚胎小脑组织免疫组化结果图(一抗为GFAP单克隆抗体Umab129)；图11示实施例5大鼠原代神经元细胞免疫荧光染色结果图(绿色为一抗GFAP单克隆抗体Umab129染色，蓝色为DAPI染色)。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1、GFAP重组表达质粒的构建以从美国傲锐东源生物科技有限公司获得的质粒RC204548(含GFAPORF1299bp)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI和MluI，克隆入表达载体pCMV6-Entry，建立GFAP重组表达质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，其与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性结合；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株Umab129产生，保藏编号为CGMCC No.15598。

【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，其与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性结合；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株Umab129产生，保藏编号为CGMCCNo.15598。2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.15598。3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测GFAP免疫检...

【专利技术属性】
技术研发人员：何为无，马东晖，扈晓敏，魏海涛，王成林，柳孟姣，姜娟，任琪，
申请(专利权)人：无锡傲锐东源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32