一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用，该方法包括以下步骤：(1)人工合成TLR2胞外区序列；(2)将TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选后得到重组质粒pET28a‑TLR2；(3)将重组质粒pET28a‑TLR2转化到大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达TLR2‑His重组蛋白；(4)将TLR2‑His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，即得。本发明专利技术制备的多克隆抗体的血清效价超过1:50000，具有特异性好、纯度高的特点，能特异性的检测到重组蛋白和组织内源性TLR2，制得的多克隆抗体为进一步研究TLR2的生物学功能提供有利的条件。

A Duck TLR2 Extracellular Domain Polyclonal Antibody and Its Preparation and Application

The invention discloses a duck TLR2 extracellular domain polyclonal antibody and its preparation method and application. The method comprises the following steps: (1) synthesizing the TLR2 extracellular domain sequence artificially; (2) constructing the TLR2 extracellular domain sequence into the expression vector pET28a, and obtaining the recombinant plasmid pET28a TLR2 after screening; (3) transforming the recombinant plasmid pET28a TLR2 into the large intestine rod. Bacteria BL21 expresses TLR2 His recombinant protein in E. coli BL21; (4) Immunize rabbits with TLR2 His recombinant protein and isolate rabbit serum. The prepared polyclonal antibody has a serum titer of more than 1:50000, good specificity and high purity, and can specifically detect recombinant protein and tissue endogenous TLR2. The prepared polyclonal antibody provides favorable conditions for further study of the biological function of TLR2.

【技术实现步骤摘要】
一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种抗体的制备方法，具体涉及一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
TLR2是TLRs家族的重要成员，主要表达在单核巨噬细胞表面，不仅介导对病原分子模式的识别，还能介导对热休克蛋白、透明质酸片段、纤黏连蛋白等内源性非感染抗原的识别，故TLR2不仅是连接天然免疫和获得性免疫的关键分子，而且在非感染性组织损伤及组织修复过程中有重要作用。目前，哺乳动物与非哺乳脊椎动物如人、鼠、牛、猪和鸡等的TLR2结构与功能已有大量研究。现已证明，人、小鼠和牛TLR2基因CDS全长均为2355bp，编码784aa，其中C-端富亮氨酸重复序列(LRRs)54aa，TIR同源区145aa；猪TLR2基因CDS全长2358bp，编码785aa，其中C-端LRRs51aa，TIR同源区145aa。Huang发现鸡TLR2有两种亚型，其中chTLR2-1基因CDS全长2382bp，编码793aa，TIR同源区145aa；chTLR2-2基因CDS全长2346bp，编码781aa，TIR同源区145aa。李国勤报道dTLR2基因编码区全长2382bp，由1个开放阅读框组成，编码793aa，其中亮氨酸为14.2％，含有24个氨基酸的信号肽序列，属于I型跨膜受体，其TIR同源区145aa，与chTLR2-1蛋白TIR区域相同。与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0％、63.5％、61.4％、60.0％和58.4％，表明dTLR2在物种中相对保守。其他物种特别是模式动物中已有多种TLRs家族成员的抗体制备和功能研究，某些已经形成商业产品，但这一研究在家禽TLRs研究中，特别是水禽研究中未见报道。dTLR2抗体的制备和外源添加，能否阻断鸭机体中dTLR2信号通路，进而发挥其各种生物学效应，如抑制机体炎症应答能力，为研制生物大分子药物提供靶点，都是值得期待的研究方向。因此，研究鸭TLR2胞外区多克隆抗体及其制备方法，具有重要的意义。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的问题，本专利技术提供了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法与应用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)根据TLR2的胞外区域的氨基酸序列，合成TLR2胞外区核酸序列，以该序列为模板扩增TLR2胞外区序列；(2)将扩增得到的TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选含有目的片段的阳性克隆，得到重组质粒pET28a-TLR2；(3)将重组质粒pET28a-TLR2转化到大肠杆菌BL21(DE3)，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达TLR2-His重组蛋白；(4)将TLR2-His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，得到所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体。其中，步骤(1)中，合成TLR2胞外区序列如SEQIDNo.1所示。步骤(2)中，扩增所用的上游引物序列如SEQIDNo.2所示，所用下游引物序列如SEQIDNo.3所示。所述上下游引物序列中含有限制性内切酶EcoR1、HindШ的酶切位点。步骤(2)中，用限制性内切酶EcoR1、HindШ双酶切TLR2胞外区序列和pET28a，电泳分离并回收酶切产物，用T4连接酶连接。步骤(3)中，通过镍柱纯化重组蛋白，重组蛋白的分子量为29kDa。步骤(4)中，家兔选择新西兰大白兔，免疫前采血作阴性对照，在兔皮内多点注射方式免疫5次，免疫剂量为1mg/只。免疫间隔选择为：一免3周后进行二免，随后每间隔2周后进行三免，四免和五免。本专利技术还提供了上述任一项的制备方法制得的鸭TLR2胞外区多克隆抗体。本专利技术还提供了所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体在制备TLR2介导的免疫保护及其靶向药物中的应用，所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体能够干预TLR2介导的炎症反应和相关病理过程。TLRs作为将细胞抗原识别信息向细胞内传导并引发炎症反应的关键蛋白，为疾病发生机制的研究提供了方向，是研究鸭抗病力的重要候选基因。TLR2胞外区多克隆抗体为干预TLR2介导疾病进程提供了一种新方法。本专利技术的有益效果为：本专利技术制备的多克隆抗体的血清效价超过1:50000，具有特异性好、纯度高的特点，能特异性地检测到重组蛋白和组织内源性TLR2，制得的多克隆抗体为进一步研究TLR2的生物学功能提供了有利的条件。附图说明图1为本专利技术TLR2胞外区氨基酸结构域预测图；图2为本专利技术重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；图3为本专利技术兔多抗血清效价结果图；图4为本专利技术重组蛋白Western-blot检测图；图5为本专利技术重组蛋白特异性的Western-blot检测图；图6为本专利技术重组蛋白Western-blot试验效价检侧图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行详细地解释说明。鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：(1)鸭TLR2胞外区的片段扩增运用PredictProtein软件对鸭的HQ166194.1(16S核糖体RNA编码基因序列)编码氨基酸进行结构分析，推测活性胞外区范围，筛选拟进行重组蛋白表达区域。本专利技术以HQ166194.1为基础，与NCBI已发表的鸭TLR2编码序列比对分析后，运用PredictProtein软件进行分析，该基因编码693个氨基酸，1-25aa为信号肽序列，氨基酸展示为2次跨膜，558-577，598-617为跨膜区；648-693aa位置为TIR区域，在预测胞外区分析有亮氨酸富集的重复序列，结构域分析如图1所示。根据上述蛋白分析所确定的序列范围，人工合成目标序列片段，合成的目标序列片段如SEQIDNo.1所示。用DNAstar软件分析设计出一对扩增所用引物F-ccgatggcaacccatacctggcaggt(SEQIDNo.2)，画波浪线序列为限制性内切酶EcoR1的酶切位点，R-gggttcacgaatttccagccaaa(SEQIDNo.3)，画波浪线序列为限制性内切酶HindIII的酶切位点，上述引物序列中画横线的序列为引物中起止序列。在上下游引物的5＇末端分别加上相应酶切位点(EcoR1，HindIII)。其中，以上述人工合成序列为模板进行PCR扩增以获得足够量核酸产物进行后续重组质粒的构建工作。PCR加样体系和循环体系如下：加样体系(50μL)：合成基因序列：1μL上游引物：0.8μL下游引物：0.8μLdTNP：1.5μL10×buffer：5μLRtaq酶：0.8μL水：40.1μL循环体系95℃3min预变性95℃40s58℃30s72℃30s25个循环最后72℃延升10min。(2)重组质粒的构建使用限制性内切酶EcoR1和HindIII分别双酶切上述PCR产物和pET28a质粒，电泳分离并回收酶切产物，用T4连接酶20℃过夜连接酶切后的目的片段和pET28a载体，通过卡那霉素筛选重组质粒，所获得的阳性克隆送上海生工生物工程公司测序鉴定，测序后将比对正确的重组质粒进行下一步。(3)重组蛋白SDS-PAGE分析和浓度测定重组质粒转化到表达系统大肠杆菌BL21(DE3)，根据PET表达系统操作手册优化重组蛋白诱导条件(IPTG终浓度为0.4mM，诱导培养时间4h)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)根据TLR2的胞外区域的氨基酸序列，合成TLR2胞外区核酸序列，以该序列为模板扩增TLR2胞外区序列；(2)将扩增得到的TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选含有目的片段的阳性克隆，得到重组质粒pET28a‑TLR2；(3)将重组质粒pET28a‑TLR2转化到大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达TLR2‑His重组蛋白；(4)将TLR2‑His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，得到所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)根据TLR2的胞外区域的氨基酸序列，合成TLR2胞外区核酸序列，以该序列为模板扩增TLR2胞外区序列；(2)将扩增得到的TLR2胞外区序列构建至表达载体pET28a，筛选含有目的片段的阳性克隆，得到重组质粒pET28a-TLR2；(3)将重组质粒pET28a-TLR2转化到大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中表达TLR2-His重组蛋白；(4)将TLR2-His重组蛋白免疫家兔，分离免疫家兔血清，得到所述鸭TLR2胞外区多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，合成出TLR2胞外区序列如SEQIDNo.1所示。3.根据权利要求1所述的鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增所用的上游引物序列如SEQIDNo.2所示，所用下游引物序列如SEQIDNo.3所示。4.根据权利要求3所述的鸭TLR2胞外区多克隆抗体的制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱春红，李慧芳，陶志云，徐文娟，宋卫涛，刘宏祥，章双杰，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32