本发明专利技术提供了用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，其是下列核苷酸序列中的一种：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；在所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列上的两端均截短相同长度的核酸适配体，且所述截短长度为1‑11bp；其中两端均截短1‑11bp的核酸适配体具有一一对应的SEQ ID NO.12‑SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了所述核酸适配体的筛选方法及其应用。该核酸适配体特异性强，与盐酸克伦特罗类似物不存在交叉反应；亲和力高，亲和力常数为(42.17±8.97)nM；灵敏度高：能检测到盐酸克伦特罗的最低检测限为1.2ng/mL。
【技术实现步骤摘要】
用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体及其筛选方法与应用
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体及其筛选方法与应用。
技术介绍
盐酸克伦特罗(Clenbμterol，CBL)，是一种β肾上腺素受体激动剂，起初用于治疗哮喘。CBL进入畜禽体内后，可明显促进动物生长，并增加瘦肉率。人食用这种含有盐酸克伦特罗的动物可食部位后会引起食物中毒。我国农业部在1997年3月(农牧发[1997]3号文)严令禁止肾上腺素在动物生产中的应用。但受经济利益的驱使，畜禽产品中CBL超标的事件时有发生。因此，有必要长期监测畜禽产品中CBL的残留，对保护人类健康具有十分重要的意义。CBL残留的主要对象为家畜，而消费者每天对家畜类食物的需求量极大。因而，对监测CBL残留相关产品的检测速度要求极高。现行普遍应用的是胶体金免疫层析试纸条和酶免疫分析试剂盒，这类检测产品的核心试剂是抗体。但抗体制备过程极其复杂、批次差异性较大。寻找与抗体功能类似的识别分子具有极其重要的意义。核酸适配体是通过体外富集级指数技术SELEX筛选制备的单链DNA或RNA，有特异性强、亲和力高、靶标范围广和易修饰等优点。在食品安全检测领域具有极其广阔的应用前景。但就食品中小分子危害物而言，分子量小，制备其特异性核酸适配体是亟待解决的瓶颈问题。瓶颈问题在于：第一、与生物大分子相比，筛选识别小分子危害物的核酸适配体相对困难。特别是靶标分子的固定，常规的筛选方法，需将靶标分子进行固定，固定前小分子靶标必须通过一定的方式与载体偶联。易导致筛选到的核酸适配体并不识别小分子本身，而是识别其衍生物。这并不能达到筛选特异性核酸适配体的要求。第二、核酸适配体文库经过多轮SELEX筛选后，均需进行单克隆适配体的识别活性鉴定。现有常规技术方法是将富集文库进行TA克隆，随机挑取一定数量的克隆进行测序和活性鉴定。这种方法挑取的克隆数量有限，而且经常挑选到易扩增的重复克隆。然而，研究发现出现频率高的重复克隆往往并不一定是有亲和力的克隆。现行应用的识别小分子危害物的核酸适配体仅仅少量几个明星适配体。因而，筛选识别更多小分子危害物的核酸适配体十分有必要。对比文件1：申请号为“CN201510485760.0”，名称为“一种与瘦肉精特异结合的核酸适配体及应用”公开了一种利用selex技术得到的能够高亲和力高特异性结合瘦肉精的核酸适配体，该核酸适配体是一种单链DNA，由84个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；其二级结构含有突出的环和茎，且存在G四链体结构，吉布斯自由能DG＝-16.04；该核酸适配体通过酶联寡核苷酸吸附试验能特异性检测到瘦肉精。第一，其采用的是固定配体的方法，但小分子配体固定后十分容易导致筛选到识别偶联物的适配体，易导致筛选到的核酸适配体并不识别小分子本身，而是识别其偶联物，这并不能达到筛选特异性核酸适配体的要求。且没有明确提及适配体的筛选轮数以及筛选过程是否富集的监测方法。第二，对比文件通过TA克隆过程中产生的阳性克隆进行测序得到。但TA克隆过程经过体内转化、转化效率对最终的测序结果会产生明显的影响。对比文件2：论文“SelectionandApplicationofssDNAAptamersagainstClenbuterolHydrochlorideBasedonssDNALibraryImmobilizedSELEX”通过16轮筛选，筛选出5条有亲和力的核酸适配体。第一，其筛选轮数是本专利的两倍，耗费时间过长。第二，其采用的是TA克隆测序的方法，序列信息量偏少。第三，其采用荧光适配体-氧化石墨烯方法进行应用，适配体需要荧光修饰，检测成本高。因而筛选出高特异性和高亲和力识别盐酸克伦特罗的核酸适配体迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，能高特异性和高亲和力识别盐酸克伦特罗；本专利技术还提供了所述核酸适配体的筛选方法，利用指数级富集配体的系统进化技术，以磁珠为分离方法，无需将靶分子固定在载体上，以盐酸克伦特罗完整的结构为靶标，筛选获得与靶分子高亲和力特异结合的适配体；采用纳米金生物传感法对富集后大量核酸适配体进行快速、高通量鉴定。本专利技术是这样实现的：在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，其是下列核苷酸序列中的一种：具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；在所述SEQIDNO.1的核苷酸序列上的两端均截短相同长度的核酸适配体，且所述截短长度为1-11bp；其中两端均截短1-11bp的核酸适配体具有一一对应的SEQIDNO.12-SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。优选地，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。优选地，所述核酸适配体还包括的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇或叶酸标记。具体地，所述具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dG＝-16.01；所述具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dG＝-13.76。在本专利技术的第二方面，提供了所述核酸适配体的筛选方法，包括如下步骤：步骤1、人工合成的ssDNA文库；步骤2、将所述文库固定于磁珠表面，将靶物质CBL与文库孵育，利用游离的小分子去捕获磁珠上的核酸适配体；步骤3、筛选并分离出与靶物质CBL结合的ssDNA；步骤4、PCR扩增，变性成单链，制备次级文库；步骤5、富集筛选；步骤6、高通量测序；步骤7、纳米金生物传感法鉴定核酸适配体的结合活性，筛选得到亲和力高的核酸适配体。优选地，所述步骤2中，将所述文库溶解，加入biotin引物，所述biotin引物与文库的摩尔比为2:1，后加入SA磁珠中固定30-45min。优选地，所述步骤4中PCR扩增时将全部洗脱液加入乳浊液PCR混合体系中混匀，再加入乳化剂，涡旋后制备乳浊液，静置5min，进行PCR扩增。优选地，所述步骤5中同时采用实时荧光定量PCR监测文库富集情况。优选地，所述步骤7中，具体采用柠檬酸三钠还原四氯金酸法合成纳米金，纳米金合成后，离心去除上清，超纯水复溶，核酸适配体终浓度0.4μM，分别与1μg/mLCBL孵育30min，加入纳米金孵育30min，加入0.9MNaCl，根据纳米金的变色情况，以及计算(A620nm和A520nm)值，从而筛选出亲和力最高的核酸适配体。在本专利技术的第三方面，提供了所述的核酸适配体在识别盐酸克伦特罗或在制备检测盐酸克伦特罗的试剂盒中的应用。本专利技术具有的有益效果是：1、本专利技术提供的一种用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，可快速、便捷检测盐酸克伦特罗，特异性强：与盐酸克伦特罗类似物不存在交叉反应；亲和力高，亲和力常数为(42.17±8.97)nM；灵敏度高：线性检测范围为0.01μg/mL-4μg/mL，能检测到盐酸克伦特罗的最低检测限为1.2ng/mL；2、本专利技术提供的一种用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，与现有识别盐酸克伦特罗的核酸适配体相比，本专利中核酸适配体的序列组成是独特的，且核酸适配体可为全本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一种：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；在所述SEQ ID NO.1的核苷酸序列上的两端均截短相同长度的核酸适配体，且所述截短长度为1‑11bp；其中两端均截短1‑11bp的核酸适配体具有一一对应的SEQ ID NO.12‑SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测盐酸克伦特罗的核酸适配体，其特征在于，其是下列核苷酸序列中的一种：具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；在所述SEQIDNO.1的核苷酸序列上的两端均截短相同长度的核酸适配体，且所述截短长度为1-11bp；其中两端均截短1-11bp的核酸适配体具有一一对应的SEQIDNO.12-SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括在所述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、氧甲基化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化的核酸适配体。3.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体还包括的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇或叶酸标记。4.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dG＝-16.01；所述具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的核酸适配体的二级结构具有突出的环和茎，吉布斯自由能dG＝-13.76。5.一种如权利要求1-4任一所述核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、人工合成的ssDNA文库；步骤2、将所述文库固定于磁珠表面，将靶物质CBL与文库孵育，利用游离的小分子去捕获磁珠上的核酸适配体；步骤3、筛选...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘细霞，侯建军，陆琪，王芳，侯垚瑶，孟晨，胡田媛，陈思锐，
申请(专利权)人：湖北师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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