中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用，所述核酸适配子A53序列为：5’‑AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCAC GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA‑3’；该核酸适配子A53可应用于分析检测NGAL的非疾病诊断中、制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中以及研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中。

【技术实现步骤摘要】
中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用
本专利技术涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用。
技术介绍
急性肾损伤(AcuteKidneyInjury，AKI)是一种肾小球滤过率急剧下降所导致的临床常见疾病，临床表现包括血清尿素氮和血清肌酐水平突然并持续升高，同时伴有盐水失衡。AKI是各种严峻条件下的一种最为常见的综合症，住院患者中的发病率为5％-7％，而危重患者中高达30％，并且患有AKI的危重患者的死亡率高达50％。此外，AKI与不良转归密切相关，包括死亡率增加、住院时间延长、危重患者的机械通气持续时间延长，及发展为慢性肾脏疾病风险增加等。中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(Neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，又名脂质运载蛋白2、噬铁蛋白或癌基因24p3，分子量25kD，在体内以多种形式存在，单体、46kD的同源二聚体、与金属蛋白酶9(MatrixMetalloproteinase9，MMP-9)结合形成的135kD的异源二聚体。NGAL在各种损伤后合成增加，尤其是肾脏疾病，被认为是最有前景的肾脏内科临床标志物。研究表明NGAL与AKI密切相关，在AKI患者的血清和尿液中NGAL水平显著升高，并且升高程度与肾脏损伤严重程度相关，因此NGAL是早期诊断AKI的强有力的指标，在各类疾病诱发的AKI的早期诊断、预测及治疗后肾功能恢复情况的监测中有着明显的优势和临床价值，具有巨大的应用前景，运用好NGAL检测，将大大降低AKI发病率和死亡率。核酸适配子是一类具有特殊的三维立体结构(发卡，假结，凸环，G-四聚体等)，可以高特异性高亲和性结合靶标的单链DNA(SinglestrandedDNA，ssDNA)或RNA。核酸适配子通过指数富集的配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选获得，核酸适配子具有稳定性好、生产周期短、费用低、可化学合成大量生产、进行各种功能化修饰等优点，因此，核酸适配子在检测诊断方面具有广阔的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高亲和力、高特异性的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53及其筛选方法和应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：它的序列如下所示：AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCAC40GTTATCATCGTAAACCCTATGCGTGCTACCGTGAA75；在25℃，0.1MNa+，0.001MMg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在分析检测NGAL的非疾病诊断中的应用。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在制备中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的纯化试剂中的应用。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的应用，在研制治疗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白相关疾病药物中的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：本专利技术通过SELEX方法筛选获得的核酸适配子A53能高亲和力、高特异性地与NGAL结合，其中Kd值为32.52nM，其在AKI诊断方面具有应用前景。该核酸适配子A53能够用于建立ELAA检测方法(酶联核酸适配子分析)，利用核酸适配子A53建立的ELAA检测方法能够特异性检测NGAL，且线性范围为125ng/mL-4000ng/mL，灵敏度为30.45ng/mL，板内和板间变异系数CV值均小于15％，回收率在80％-110％之间。附图说明图1为核酸适配子A53的二级结构模拟图。图2为qPCR法比较候选适配子与NGAL结合量结果图。图3为核酸适配子A53的特异性分析结果。图4为核酸适配子A53的亲和力检测结果。图5为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的特异性分析结果。图6为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的标准曲线。图7为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法的灵敏度分析结果。图8为基于核酸适配子A53所建立的ELAA检测方法检测尿液样本的结果图。图9为核酸适配子A53的SELEX筛选策略图。图10为ELAA检测方法的检测策略图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，它的序列如下所示：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCACGTTATCATCGTAAACCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’如图1所示：所述核酸适配子A53的结构为：以茎环结构为基础，连接大小不一的环。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，对所述核酸适配子A53的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，它包括以下步骤(核酸适配子A53的SELEX筛选策略图见图9)：①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；其中，所述ssDNA库，两端为20nt的固定引物序列，中间35nt为随机序列，其序列为：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N35-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’；所述引物P1、P2、P3、P4分别为：引物P1：5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’，引物P2：5’-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3’，引物P3：5’-FAM-AGCAGCACAGAGGTCAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：它的序列如下所示：AGCAGCACAG AGGTCAGATG GCGCTGGATA GCAAGATCAC 40GTTATCATCG TAAACCCTAT GCGTGCTACC GTGAA 75；在25℃，0.1M Na+，0.001M Mg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：它的序列如下所示：AGCAGCACAGAGGTCAGATGGCGCTGGATAGCAAGATCAC40GTTATCATCGTAAACCCTATGCGTGCTACCGTGAA75；在25℃，0.1MNa+，0.001MMg2+条件下其二级结构为茎环结构，其分子结构如下：2.根据权利要求1所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53，其特征在于：对所述核酸适配子A53的5'端或3'端进行FAM、Biotin或氨基化学修饰。3.根据权利要求1或2所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，其特征在于：基于核酸适配子的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以NGAL为靶标，通过NGAL羧基磁珠从ssDNA库中筛选得到与NGAL特异性结合的核酸适配子。4.根据权利要求3所述的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白核酸适配子A53的筛选方法，其特征在于：它包括以下步骤：①包被NGAL的磁珠与ssDNA库孵育进行SELEX筛选，并从第三轮开始在每轮筛选之前加入裸磁珠进行前反筛，以此去除与磁珠非特异结合的ssDNA；②孵育洗涤后的磁珠进行热洗脱，洗脱下来的ssDNA作为模板，加入带荧光修饰的上游引物P3与带PolyA尾的下游引物P4进行PCR扩增；③PCR扩增产物用正丁醇浓缩后经10％7M尿素变性PAGE胶电泳，使得带荧光修饰的75nt的目的链与PolyA修饰的95nt的互补链分离；④切取75nt位置带荧光的目的链条带进行胶回收、乙醇纯化，作为进行下一轮SELEX筛选的次级ssDNA库；⑤将步骤④所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，进行循环筛选；第8轮筛选后，以第8轮SELEX筛选后的产物库8ssDNA为模板，用P1和P2进行扩增、纯化，得纯化后的PCR扩增产物；接着对纯化后的PCR扩增产物进行TA克隆，之后随机挑取克隆菌落，进行测序；其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰小鹏，洪笑迁，刘宽灿，王开宇，谢富安，杨坤荣，黄素红，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区福州总医院，
类型：发明
国别省市：福建,35