本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域，提供了与节球藻毒素‑R特异性结合的适配体及其应用。适配体的序列通式为：5’‑AAGGAGCAGCGTGGAGGATA‑‑N40‑TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT‑3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量，优选为如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7中任一条所示的序列，最优选为如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.11中任一条所示的序列，可以制备成适配体传感器或检测试剂，并将其应用于饮用水体样品中NOD‑R的检测，还可以为预防或治疗NOD‑R中毒药物的制备以及水体或水产品中NOD‑R的去除奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
与节球藻毒素-R特异性结合的适配体及其应用
本专利技术涉及生物医药工程
，具体涉及一种与节球藻毒素-R特异性结合的适配体及其应用。
技术介绍
节球藻毒素-R(Nodularin-R，NOD-R)是一种强烈的蓝藻肝毒素，主要由丝状浮游蓝藻节球藻(Nodulariaspumigena)产生。研究表明，NOD-R不仅具有促癌作用，而且还是一种致癌剂，其作用机理为通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1(PP1)和2A(PP2A)的活性，进而发挥毒性作用。自1988年起，研究者们共发现了十种NOD，其中，NOD-R是含量最多的，也是唯一商业化的毒素。NOD-R易溶于水，而且耐热性强，加热煮沸都不能将毒素破坏。人们主要因饮用被污染的水和误食被污染的水产品而中毒，中毒症状包括腹泻、呕吐和口眼分泌物增多等，严重时可导致死亡。国内外卫生组织都将饮用水中NOD-R的最高含量规定为1μg/L。随着水体富营养化的加剧，蓝藻水华事件愈加频繁，NOD-R的污染也越来越严重。因此，亟需建立一种准确、灵敏的NOD-R检测方法，以便更好的监控水体和水产品中NOD-R的水平，进而保障人们和水生生物的安全。目前，常用的NOD-R的检测方法主要分为三大类，即生物分析法、物理化学分析法和免疫化学法。其中，小鼠生物法(MBA)是应用最广的生物分析方法。然而，该方法不仅灵敏度低、重现性差，而且还存在伦理道德问题。化学分析法，如高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)和液质联用(LC-MS)等也逐渐建立。其中，多种化学仪器联用的方法因能够大大提高检测的灵敏度而获得了越来越多的研究者们的青睐。然而，该方法需要进行复杂的样品前处理过程，所用仪器设备昂贵，而且还需要专业的技术人员。免疫化学法因灵敏度低、特异性高而被广泛应用，但是，该方法不仅步骤繁琐，而且还存在交叉反应。因此，亟需建立一种快速、灵敏的新型检测方法。近年来，生物传感器检测法因能克服传统检测方法的众多缺点而备受研究者们的关注。生物传感器的核心部分是分子识别元件，抗体是一种很好的分子识别元件，但是，抗体不仅价格昂贵，而且容易变性。因此，需要寻找一种新的分子识别元件。1990年，Tuerk和Gold首次通过指数富集的配基系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX)，成功筛选到了亲和力高、特异性强的T4DNA聚合酶适配体。适配体，即具有功能的单链寡核苷酸，包括ssDNA和RNA，能够形成发夹、假结和G-四链体等空间结构，并通过分子间的相互作用，如疏水作用、范德华力和氢键等特异性识别并结合靶分子。作为一种新型分子识别元件，适配体与抗体相似，但优于抗体。例如，适配体能够识别多种靶标，如蛋白质、氨基酸以及金属离子等，甚至细胞和病毒；适配体能够与多种基团连接，修饰方便；适配体化学性质稳定，不容易变性；适配体可以直接化学合成，成本低廉。目前，已经有很多研究者们将适配体与多种生物传感器平台，如电化学、比色分析和表面等离子共振等相结合，制备快速、灵敏的新型蓝藻毒素检测方法。然而，还没有关于NOD-R适配体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为解决上述技术问题进行的，目的在于提供一种与节球藻毒素-R特异性结合的适配体及其应用。本专利技术的目的在于提供多条能够与NOD-R以很高的亲和力特异性结合的单链DNA适配体，并对该多条适配体与NOD-R之间的亲和力进行测试，得到亲和力常数(KD)值最小的一条适配体N13。本专利技术的第二目的在于以截短的方式对该适配体N13进行优化，提供结合能力相当，但是长度更短的NOD-R适配体(N13-T-02)。本专利技术的第三目的在于提供适配体的应用，如适配体在制备节球藻毒素-R分离富集试剂中的应用，在制备节球藻毒素-R检测试剂、试剂盒或传感器中的应用，在制备治疗节球藻毒素-R中毒药物中的应用，以及在自来水样品中NOD-R的快速检测中的应用，并为预防或治疗NOD-R中毒药物的制备和水体或水产品中NOD-R的去除奠定基础。本专利技术的主要技术方案是：通过磁珠-SELEX技术筛选并得到一条能够与NOD-R以很高的亲和力特异性结合的单链DNA适配体(N13)。根据在线工具themfoldwebserver对其二级结构的预测结果，对适配体N13进行截短，并得到优化后的适配体N13-T-02。通过与生物传感器平台相结合，可以制备NOD-R适配体传感器，并将其用于NOD-R的快速检测。此外，NOD-R适配体还可以为预防或治疗NOD-R中毒药物的制备以及水体或水产品中NOD-R的去除奠定基础。本专利技术的第一方面提供了与节球藻毒素-R特异性结合的适配体，该适配体的序列通式为：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。通过磁珠-SELEX技术筛选，得到如下代表性序列：N7：如SEQIDNO.1所示；N13：如SEQIDNO.2所示；N32：如SEQIDNO.3所示；N36：如SEQIDNO.4所示；N49：如SEQIDNO.5所示；N62：如SEQIDNO.6所示；N71：如SEQIDNO.7所示。本专利技术的第二方面是以截短的方式对适配体N13进行优化，提供结合能力相当，但是长度更短的四条NOD-R适配体，分别被命名为适配体N13-T-O1、适配体N13-T-O2、适配体N13-T-O3和适配体N13-T-O4。在这4条适配体中，除了适配体N13-T-O4，其余适配体都能和NOD-R结合，而且亲和力均有所提高，其中，适配体N13-T-O2与NOD-R之间的亲和力最高，达到了29.6nM。适配体N13-T-O1～适配体N13-T-O3的序列如SEQIDNO.9～SEQIDNO.11所示，优选N13-T-O2序列。优选的，上述适配体N13-T-O2，可以在其3’端或5’端进行生物素、FITC和巯基等化学修饰。本专利技术的第三方面提供了适配体的应用，如在制备节球藻毒素-R分离富集试剂中的应用；在制备节球藻毒素-R检测试剂、试剂盒或传感器中的应用；在制备治疗节球藻毒素-R中毒药物中的应用。优选的，治疗节球藻毒素-R中毒药物是以与节球藻毒素-R特异性结合的适配体作为唯一活性成份或者是包含与节球藻毒素-R特异性结合适配体的药物组合物。本专利技术的第四方面，提供了一种与节球藻毒素-R特异性结合的适配体的药物组合物，以与节球藻毒素-R特异性结合的适配体作为活性成份，还包括医学上可接受的药物载体。优选的，药物组合物为去除水体或水产品中节球藻毒素-R制剂。本专利技术的药物组合物和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物，从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本专利技术公开的适配体核心序列的构像完整性，同时还能保护蛋白质的多官能团，防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。本专利技术的第五方面是提供了适配体N13-T-02在自来水样品中NOD-R的快速检测中的应用，防止人们主要因饮用被污染的水和误食被污染的水产品而中毒。本专利技术的有益保障及效果：本专利技术提供了一种与节球藻毒素-R特异性结合的适配体及其应用，通过实验验证，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.与节球藻毒素‑R特异性结合的适配体，其特征在于，所述适配体的序列通式为：5’‑AAGGAGCAGCGTGGAGGATA‑N40‑TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT‑3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。
【技术特征摘要】
1.与节球藻毒素-R特异性结合的适配体，其特征在于，所述适配体的序列通式为：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-N40-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’；其中，N为A、T、G、C四种脱氧核糖核苷酸碱基中的任意一个，40代表随机碱基的数量。2.根据权利要求1所述的与节球藻毒素-R特异性结合的适配体，其特征在于：其中，所述适配体的序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.7中任一条所示。3.与节球藻毒素-R特异性结合的适配体，其特征在于，所述适配体的序列如SEQIDNO.9～SEQIDNO.11中任一条所示。4.权利要求1～3任一项所述的与节球藻毒素-R特异性结合的适配体在制备节球藻毒素-R分离富集试剂中的应用。5.权利要求1～3任一项所述的与节球藻毒素-R特异性结合的适配体在制备节球藻毒素-R检测试剂、试剂盒或传感器中的应用。6.权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳生群，胡波，刘德婧，周蓉，李振钢，李真，焦炳华，王梁华，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31
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