一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用，所述DNA适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。所述筛选方法包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。本发明专利技术的DNA适配体可应用于设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中。与现有技术相比，本发明专利技术的DNA适配体具有特异性好、性能稳定且制备成本低等优点。

A DNA Adaptor Specifically Recognizing Hepatocellular Carcinoma Stem Cells and Its Screening Method and Application

The present invention discloses a DNA adapter specifically identifying hepatocellular carcinoma stem cells and its screening method and application. The nucleotide sequence of the DNA adapter includes a characteristic sequence part as shown in Seq ID No.1. The screening method includes the following steps: using in vitro screening technology of nucleic acid aptamers, using CD133 positive expression hepatocellular carcinoma cell lines as positive screening targets, CD133 negative expression hepatocellular carcinoma stem cells as negative screening targets, and screening out the specific binding nucleic acid aptamers of the hepatocellular carcinoma cell lines from random oligomer libraries synthesized in vitro. The DNA adapter of the invention can be used in designing and preparing anti-hepatoma drugs or detection reagents. Compared with the prior art, the DNA adapter of the invention has the advantages of good specificity, stable performance and low preparation cost.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用。
技术介绍
原发性肝癌是全世界范围内最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，为全球第五大癌症之一，死亡率位居第3位。中国是肝癌新发病例人数最多的国家，其5年生存率低于5％，并且发病率仍在逐年升高，为社会带来了沉重的经济负担。目前，肝癌的主要治疗手段包括手术治疗、肝移植、射频消融治疗和肝动脉化疗栓塞术，其中，手术治疗和肝移植是相对最为成熟的治疗方法。由于手术治疗可以根治，因此，手术治疗是肝癌治疗的首选方法，然而术后复发却是至今无法解决的难题，且复发率极高。而对于合并有肝硬化的肝癌患者，肝移植是最有前景的治疗手段，但由于供体肝短缺，使得肝移植的开展受到极大的限制。综上所述，由于各治疗手段的局限性，导致肝癌患者的生存率低下，迫切需要结合肝癌的发病机制研究进一步开发新的治疗方法。肿瘤干细胞假说认为在肿瘤组织中存在一种数量较少的肿瘤干细胞，被认为是肿瘤增殖、侵袭、转移及复发的根源。目前，在白血病、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞。肝癌中存在肿瘤干细胞与其难治、复发及耐药等特点密切相关，而这些特点也表明了肝癌很可能也是一种肿瘤干细胞疾病，已有报道称，利用细胞表面分子分离出的肝癌干细胞在复发、耐药等方面发挥着重要作用。CD133/prominin-1是一种造血干细胞和神经干细胞的表面标志物，近期研究发现，CD133也在多种实体肿瘤的肿瘤干细胞中表达，在体内发挥着多种生物学作用，且有研究已经表明CD133是肝癌干细胞的重要标志物。核酸适配体是由DNA/RNA单链构成的核酸分子，可特异性地识别单个蛋白或小分子，其具有与抗体相媲美的亲和力和特异性，同时又具备抗体所无法媲美的优点，如不易受pH、温度等环境因素影响而变性且价格便宜；可在体外筛选；无免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、改造与标记；化学稳定性好，能可逆变性与复性、可通过酶扩增、剪切等，这些优点使得其在生物医学领域具有广阔的应用前景。因此，找出一种特异性针对肝癌的核酸适配体将其应用于肝癌的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种具有高度特异性且性能稳定的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法与应用，该适配体能够特异性识别CD133阳性表达的肝癌PLC8024细胞株及其衍生物。一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，所述DNA适配体的核苷酸序列包括如SeqIDNo.1所示的特征序列部分。进一步地，所述肝癌干细胞选自CD133表达的肝癌干细胞。进一步地，所述肝癌干细胞选自PLC8024肝癌细胞株。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的可识别肝癌细胞株的核酸适配体能特异性识别肝癌组织，且对有CD133阳性表达的肝癌诊断，转移的预测和治疗提供新的思路，尤其对肝癌的早期检测具有重要意义。本专利技术还包括上述DNA适配体的筛选方法，包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞株为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；S4、负筛：将所述步骤S3得到的正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲和力，最终得到带有如SeqIDNo.1所示的特征序列的DNA适配体。优选地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：S11、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S21、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；S31、PCR扩增文库：将所述核酸适配体一级文库进行PCR扩增，得到扩增产物；S41、正筛：将所述步骤S31得到的扩增产物的上清与CD133阳性的PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；S51、负筛：将所述步骤S41得到的正筛适配体组文库与CD133阴性的PLC8024细胞株孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的适配体组文库；S61、核酸适配体循环筛选：重复步骤S11～S51至少一次，以扩增产物代替随机文库，直到得到的适配体组文库与靶细胞的亲和力选择性不再上升；S71、测序鉴定：克隆测序所述步骤S61得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性和亲和力，最终得到带有如SeqIDNo.1所示的特征序列的DNA适配体。进一步地，所述筛选方法还包括筛选操作开始之前进行肝癌干细胞分选的步骤，具体为：用CD133抗体标记PLC8024肝癌细胞株后，用流式细胞仪分选得到CD133阳性的PLC8024肝癌干细胞作靶标。本专利技术的有益效果在于：采用本专利技术方案筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力及特异性无免疫原性，能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存便于标记且二抗不需要标记。本专利技术还包括将上述DNA适配体应用于设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中。本专利技术的有益效果在于：采用本专利技术的核酸适配体进行肝癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，并且本专利技术核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，周期短且重现性好；本专利技术的核酸适配体的特征序列可作为抗肝癌的分子探针或药物靶点，将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详予说明。本专利技术实施例为：一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体及其筛选方法，所述DNA适配体的核苷酸序列包括AGGAGGTTAGGGGTGGGTGGGTGGT，其筛选方法包括以下步骤：1.初始DNA文库(即一级文库)准备：设计合成两端含19个核苷酸(引物)，中间包括2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述DNA适配体的核苷酸序列包括如SeqIDNo.1所示的特征序列部分。2.根据权利要求1所述的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述肝癌干细胞选自CD133表达的肝癌干细胞。3.根据权利要求2所述的特异性识别肝癌干细胞的DNA适配体，其特征在于：所述肝癌干细胞选自PLC8024肝癌细胞株。4.一种如权利要求1-3任一项所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以CD133阳性表达肝癌细胞株为正筛靶标，以CD133阴性表达肝癌干细胞株为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与所述肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。5.根据权利要求4所述的DNA适配体的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法，具体包括以下步骤：S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；S4、负筛：将所述步骤S3得到的正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲和力，最终得到带有如SeqIDNo.1所示的特征序列的DNA适配...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，李丹，王皓帆，吕秀芳，罗慧，于海玲，刘天泽，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44