一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途，所述核酸适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。所述用途包括将上述的核酸适配体在设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中的用途。所述检测试剂包括酶联免疫反应、放射免疫测定或荧光方法检测试剂。本发明专利技术还包括一种靶向制剂和一种药物组合物，所述靶向制剂包括上述核酸适配体及选自制药上可接受的载体或赋形剂。所述药物组合物包括上述核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物及制药上可接受的载体。与现有技术相比，本发明专利技术的适配体能够特异性识别肝癌细胞，具有良好的应用前景。

A Nucleic Acid Adapter for Recognition of Hepatocellular Carcinoma Cells and Its Screening Method and Application

The present invention discloses a nucleic acid adapter for identifying hepatocellular carcinoma cells and its screening method and use. The nucleic acid sequence of the nucleic acid adapter includes a characteristic sequence part as shown in Seq ID No.1. The use includes the use of the above-mentioned nucleic acid adapter in the design and preparation of anti-hepatocellular carcinoma drugs or detection reagents. The detection reagent comprises an enzyme-linked immunoreaction (ELISA), a radioimmunoassay (RIA) or a fluorescence method detection reagent. The invention also includes a targeting agent and a pharmaceutical composition, the targeting agent includes the nucleic acid adapter and a carrier or excipient acceptable on the selected medicine. The pharmaceutical composition comprises the nucleic acid adapter, at least one antineoplastic drug and a pharmaceutically acceptable carrier. Compared with the prior art, the adapter of the present invention can specifically recognize hepatocellular carcinoma cells, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途。
技术介绍
原发性肝癌是全世界范围内最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，因此，对于肝癌治疗研究刻不容缓。临床治疗方案中，手术治疗虽然可根治肝癌，但仅限于少部分患者，对于多数患者，因病灶较大或术后高复发率等因素，并不能得到治愈。因此，化疗仍是主要治疗手段，但目前肝癌的化学治疗尚缺少有效的治疗药物，以保障肝癌的化疗效果，迫切需要结合肝癌的发病机制研究进一步开发新的治疗药物或方法。肿瘤干细胞假说认为在肿瘤组织中存在一种数量较少的肿瘤干细胞，被认为是肿瘤增殖、侵袭、转移及复发的根源。目前，在白血病、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞。肝癌中存在肿瘤干细胞与其难治、复发及耐药等特点密切相关，而这些特点也表明了肝癌很可能也是一种肿瘤干细胞疾病，相关研究表明利用细胞表面分子分离出的肝癌干细胞在复发、耐药等方面发挥着重要作用。核酸适配体是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA/RNA)片段，其特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度亲和力。然而研究显示，核酸适配体相比抗体等多肽类的适配体(peptideaptamer)而言，具有明显的优势，如制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强及易于进行改造修饰等等。因此，找出一种特异性针对肝癌的核酸适配体将其应用于肝癌的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种具有高度特异性且性能稳定的识别肝癌细胞的核酸适配体及其筛选方法与用途，该适配体能够特异性识别肝癌PLC8024细胞株及其衍生物。一种识别肝癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列包括如SeqIDNo.1所示的特征序列部分。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的适配体具有高度特异性且性能稳定，该适配体能够特异性识别肝癌PLC8024细胞株及其衍生物。进一步地，所述核酸适配体的核苷酸序列为：X-GGGGGATGGAGGGTGGGTCGTATAT-Y，其中，X和Y各自独立地为A、T、C、G中的至少一个碱基或者X和Y中至少一个不存在。进一步地，所述核酸适配体的两端中至少一端具有修饰基团。进一步地，所述修饰基团包括但不限于氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团。进一步地，所述核酸适配体中具有碱基修饰。进一步地，所述碱基修饰包括但不限于经硫代、氨代、锁核酸、氟代或甲氧基修饰后。本专利技术的有益效果在于：对所述核酸适配体的碱基进行修饰，使其具有较未经修饰的核酸适配体更为优异的稳定性。本专利技术还包括上述核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以PLC8024肝癌细胞为正筛靶标，以肝脏永生化细胞LO2为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；S3、正筛：将所述步骤S2得到的核酸适配体一级文库的上清与正筛靶标孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；S4、负筛：将所述正筛适配体组文库与负筛靶标孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；S5、分析鉴定所述步骤S4所得到的负筛适配体组文库各序列的选择性、亲和力，最终得到带有如SeqIDNo.1所示的特征序列的核酸适配体。进一步地，所述筛选方法，具体包括以下步骤：S11、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S21、核酸适配体筛选：将所述随机单链文库与肝癌干细胞孵育，孵育完成后，收集PLC8024细胞株细胞加热变性分离结合在细胞株上的适配体，即为筛选所得的核酸适配体一级文库；S31、PCR扩增文库：将所述核酸适配体一级文库进行PCR扩增，得到扩增产物；S41、正筛：将所述步骤S31得到的扩增产物的上清与PLC8024细胞株孵育，洗脱结合在靶细胞表面的高亲和力适配体组，扩增后得到富集的与靶细胞特异性结合的正筛适配体组文库；S51、负筛：将所述步骤S41得到的正筛适配体组文库与肝脏永生化细胞LO2细胞株孵育，孵育完成后收集上清液，得到富集的与靶细胞特异性结合的负筛适配体组文库；S61、核酸适配体循环筛选：重复步骤S11～S51至少一次，以扩增产物代替随机文库，直到得到的适配体组文库的亲和力选择性不再上升；S71、测序鉴定：克隆测序所述步骤S61得到的适配体组文库，分别鉴定各条序列的选择性和亲和力，最终得到带有如SeqIDNo.1所示的特征序列的核酸适配体。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案采用体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematicevolutionofligandbyexponentialenrichment，SELEX)技术，筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力及特异性无免疫原性，能够体外化学合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存便于标记且二抗不需要标记。本专利技术还包括上述核酸适配体在设计、制备抗肝癌的药物或检测试剂中的用途。进一步地，所述检测试剂包括但不限于酶联免疫反应、放射免疫测定和荧光方法检测试剂。本专利技术还包括一种靶向制剂，包括上述核酸适配体。进一步地，所述靶向制剂还包括选自制药上可接受的载体或赋形剂。进一步地，所述载体选自纳米药物载体、肿瘤显影剂或染色分子中的任意一种。本专利技术还包括一种药物组合物，所述药物组合物包括上述核酸适配体，至少一种抗肿瘤药物及制药上可接受的载体。本专利技术的有益效果在于：采用本专利技术的核酸适配体进行肝癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，并且本专利技术核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，周期短且重现性好；本专利技术的核酸适配体的特征序列可作为抗肝癌的分子探针或药物靶点，将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。附图说明图1为本专利技术实施例适配体(左图)和对照适配体(右图)与PLC8024肝癌细胞株的特异性结合图；图2为本专利技术实施例适配体与肿瘤组织(左图)和癌旁组织的石蜡块(右图)特异性结合图。具体实施方式为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种识别肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列包括如Seq ID No.1所示的特征序列部分。

【技术特征摘要】
1.一种识别肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的核苷酸序列包括如SeqIDNo.1所示的特征序列部分。2.根据权利要求1所述的识别肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体的两端中至少一端具有修饰基团。3.根据权利要求1所述的识别肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体中具有碱基修饰。4.一种如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：利用核酸适配体体外筛选技术，以PLC8024肝癌细胞为正筛靶标，以肝脏永生化细胞LO2为负筛靶标，从体外合成的随机寡聚文库中筛选出与肝癌细胞株特异结合的核酸适配体。5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、合成随机单链文库和引物：所述随机单链文库为：ACCTTGGCTGTCGTGTTGT-25nt-AGGTCAGTGGTCAGAGCGT，所述引物包括5'引物：5'-FAM-ACCTTGGCTGTCGTGTTGT和3'引物：3'-Biotin-ACGCTCTGACCACTGACCT；S2、核酸适配体筛选：将所述随机单链文...

【专利技术属性】
技术研发人员：单鸿，吕秀芳，罗慧，于海玲，刘天泽，李丹，王皓帆，
申请(专利权)人：中山大学附属第五医院，
类型：发明
国别省市：广东,44