一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法，本发明专利技术所述的多组分B群脑膜炎球菌疫苗含有：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)，B群脑膜炎球菌A亚家族和B亚家族人H因子结合蛋白(factor H binding protein，fHbp)的重组脂蛋白(fHbp‑A、fHbp‑B)，B群脑膜炎球菌奈瑟菌黏附素A(neisserial adhesin A，NadA)重组蛋白，以及B群脑膜炎球菌肝素结合抗原(neisseria heparin binding antigen，NHBA)重组蛋白。本发明专利技术的疫苗用于预防由B群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病，提供对B群脑膜炎球菌广泛有效的保护作用。

【技术实现步骤摘要】
一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法，属于生物制品领域。所述多组分B群脑膜炎球菌疫苗是由B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白、以及重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例混合配制而成的疫苗制剂。
技术介绍
流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)，是由脑膜炎奈瑟菌(NeisseriaMeningitides,NM，通常称之为脑膜炎球菌)感染引起的以脑脊髓膜炎和菌血症为主的呼吸道传染病。目前以婴幼儿发病为主，呈地方性流行、暴发、散发形式，NM引起的侵袭性疾病有脑膜炎、菌血症和肺炎等，病死率约为12％～20％，幸存者中有11％～19％留有后遗症。最近，运用DNA序列分析荚膜多糖合成中的特定基因，已经代替传统的血清群用于定义分离株，脑膜炎奈瑟菌根据荚膜多糖的结构特征分为12个荚膜群。其中绝大多数的疾病由荚膜群A、B、C、W、X或Y引起。目前欧洲的流行性脑脊髓膜病例中有90％为荚膜B群所导致，而在美国，三分之一以上的的病例由荚膜B群所导致，在国内，根据流行病学调查与研究，B群脑膜炎球菌引起的病例，所占的比例逐年提高。然而，由于B群脑膜炎球菌荚膜多糖免疫原性弱，加之包含的表位和人体组织的唾液酰基蛋白存在交叉反应，而不能像A、C、W、Y等荚膜群作为疫苗成份。B群脑膜炎球菌疫苗研发主要集中在外膜囊泡即OMV和外膜蛋白上。外膜蛋白主要有效抗原为fHbp、NadA、NABH等。然而，单一重组蛋白成分的疫苗难以取得较好的免疫效果，多组分疫苗成为发展趋势，为B群脑膜炎球菌疫苗的研究带来新的方向。本专利技术的B群脑膜炎球菌多组分疫苗包含fHbp，脑膜炎奈瑟球菌外膜囊泡(OMV)，以及NadA和NHBA。B群脑膜炎球菌外膜囊泡(OutMembraneVesicle，OMV)，为整个细菌外膜上的相关蛋白和脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)等囊泡成分，具有很好的免疫原性，为目前研制与应用较为广泛的疫苗。LPS是构成革兰氏阴性菌细菌外表层的一种生物大分子，可介导固有免疫反应，高剂量时会引起发热反应、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等疾病，低剂量时，能够引起肿瘤坏死因子TNF-α及白介素IL-6等细胞因子生成，激发Toll-样受体TLR4(少量R-型LPS可拮抗TLR4，如五日热巴尔通体Bartonellaquintana的脂多糖)，帮助宿主抵御感染，因此可作为疫苗及佐剂的有效成分。LPS主要由三部分组成：O-抗原，核心多糖和类脂A。类脂A是脂多糖中最保守的部分，同一菌种的类脂A结构基本一致，它是一种磷酸糖脂(phosphoglycolipid)，其骨架结构是被磷酸基团修饰、脂肪酸链取代的β-1,6连接的D-氨基葡萄糖(GlcN)二糖。LPS的内毒素活性完全由类脂A部分决定，类脂A的酰基链数量、分布及长度等脂肪酰谱对其生物活性有显著的影响作用。类脂A的合成途径发生在细胞质和内膜的内表面，其合成反应共计10步，可溶性蛋白lpxA是催化第一步反应的酶，作用结果是在UDP-氨基葡萄糖分子上添加脂肪酸链。B群脑膜炎球菌类脂A的3,3'位为3-OH十二月桂酰基，为12碳脂肪酸链，将B群脑膜炎球菌类脂A基因lpxA以大肠杆菌类脂A同源基因lpxA替换后，其3,3'位合成为3-OH豆蔻酰基，为14碳脂肪酸链，能够显著降低LPS数量，从而降低B群脑膜炎球菌突变株的内毒素活性。fHbp蛋白为人H因子结合蛋白，是B群脑膜炎球菌外膜的脂蛋白成份。fHbp分为两个亚家族(Subfamily)，A亚家族(与变种分类法V2、V3相同)和B亚家族(与变种分类法V1相同)，基于聚类比对分析，fHbp蛋白系统发生树表明，B亚家族约占分离株的70％，A亚家族约占30％。fHbp的氨基酸序列较保守，同一亚家族内91.6％～100％氨基酸相同，不同亚家族最低为62.8％。重组fHbp免疫产生的抗体可引起对同一类亚家族的补体介导的杀菌作用，并能诱导对感染乳鼠模型的被动保护，但对不同类亚家族的菌株不具有杀菌力。fHbp重组蛋白具有良好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的杀菌抗体，且对顺序变异不敏感，其结构和保护性抗原表位可进行组合，因此完全具备作为候选疫苗免疫原性蛋白质的特征。P4为流感嗜血杆菌(HaemophilusInfluenzae)外膜脂蛋白e蛋白(亦称为P4蛋白)的信号肽，在重组表达fHbp过程中，将P4信号肽添加于蛋白N端，与B群脑膜炎球菌fHbp天然(Native)信号肽相比，能提高蛋白在大肠杆菌中的表达量，而更重要的是，P4信号肽在蛋白翻译起始后信号肽切割过程中，对与其相连的fHbp蛋白N端首个氨基酸进行脂酰化修饰，从而高效表达出具有天然活性的脂蛋白。奈瑟菌黏附素A(NeisserialAdhesinA，NadA)，即GNA1994，在B群脑膜炎球菌中具有较高的保守性，在实验动物免疫评价中能产生保护性，为B群脑膜炎球菌疫苗的有效抗原成分。奈瑟菌肝素结合抗原(NeisserialHeparinBindingAntigen，NHBA)，即GNA2132，在B群脑膜炎球菌中具有较低的保守性，但其氨基和羧基末端高度保守。重组NHBA蛋白能诱导小鼠产生抗体，且能协同OMV产生更强杀菌抗体应答。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗，能有效预防B群脑膜炎球菌的流行，对B群脑膜炎球菌提供广泛的保护作用。本专利技术所述的疫苗，包括以下成分：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白、重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白。以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV5-40μg/剂，B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白分别为20-60μg/剂，重组NadA蛋白20-100μg/剂，重组NHBA蛋白30-90μg/剂。优选的，本专利技术所述的疫苗，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV为20-30μg/剂，重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白含量分别为25-35μg/剂；重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白的含量分别为35-55μg/剂。进一步优选的，本专利技术所述的疫苗，以蛋白含量计，B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为25μg/剂、30μg/剂、30μg/剂、40μg/剂、40μg/剂。本专利技术所述的疫苗的pH为5.8-7.2；铝含量为0.4-1.2mg/ml。其中，该疫苗中还包括任选的生物制品用冻干保护剂或佐剂。本专利技术的另一目的在于提供多组分B群脑膜炎球菌疫苗的制备方法。本专利技术所述的多组分B群脑膜炎球菌疫苗，其制备方法如下：提取纯化各个疫苗组分后，通过不同剂量矩阵配比分析，确定各疫苗组分配制比例，使各组分在免疫机理上有协同促进作用。本专利技术所述疫苗的制备方法，包括以下步骤：将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白，重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例稀释配制后，采用冻干或吸附的方式配制成多组分B群脑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述疫苗包括：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp‑A脂蛋白、重组fHbp‑B脂蛋白、重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV 5‑40μg/剂，B群脑膜炎球菌重组fHbp‑A脂蛋白和重组fHbp‑B脂蛋白分别为20‑60μg/剂，重组NadA蛋白20‑100μg/剂，重组NHBA蛋白30‑90μg/剂。

【技术特征摘要】
1.一种多组分B群脑膜炎球菌疫苗，其特征在于，所述疫苗包括：B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白、重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV5-40μg/剂，B群脑膜炎球菌重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白分别为20-60μg/剂，重组NadA蛋白20-100μg/剂，重组NHBA蛋白30-90μg/剂。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，以蛋白含量计，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV为20-30μg/剂，重组fHbp-A脂蛋白和重组fHbp-B脂蛋白含量分别为25-35μg/剂；重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白的含量分别为35-55μg/剂。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，以蛋白含量计，B群脑膜球菌疫苗低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B、重组NadA蛋白、重组NHBA蛋白终浓度分别为25μg/剂、30μg/剂、30μg/剂、40μg/剂、40μg/剂。4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，该疫苗的pH为5.8-7.2；铝含量为0.4-1.2mg/ml。5.权利要求1所述的疫苗的制备方法，包括以下步骤：将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV、重组fHbp-A脂蛋白、重组fHbp-B脂蛋白，重组NadA蛋白和重组NHBA蛋白按比例稀释配制后，采用冻干或吸附的方式配制成多组分B群脑膜炎球菌疫苗。6.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV的制备：将B群脑膜炎球菌LPS类脂AlpxA基因以大肠杆菌DH5α的lpxA基因替换，得到B群脑膜炎球菌低内毒素突变株，将B群脑膜炎球菌低内毒素突变株进行发酵培养，发酵液离心并收集菌体，菌体采用低温超高压均质破碎，离心收集上清，再采用去污剂抽提、离子交换、疏水层析等纯化的方法得到纯化的B群脑膜炎球菌低内毒素突变株OMV。7.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，重组fHbp...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏桂民，郭通，纪国存，冀颖，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，重庆智飞生物制品股份有限公司，安徽智飞龙科马生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11