抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法及缀合疫苗，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连；该方法制备获得的缀合疫苗以RSV免疫原性蛋白和脑膜炎球菌多糖作为抗原，脑膜炎球菌重组蛋白为多糖载体蛋白，所述重组蛋白包括重组ΔfHbp、柔性连接肽段和NadA，所述重组ΔfHbp包含fHbp可变体V1的VA、VB结构域以及fHbp可变体V3的VC、VD、VE结构域。

Anti RSV and meningococcal conjugate vaccine and its preparation method

The invention discloses a preparation method and a conjugated vaccine for anti-RSV and meningococcal conjugated vaccine. The method is used for preparing a conjugated vaccine including RSV immunogenic protein, meningococcal polysaccharide and meningococcal carrier protein. The conjugated vaccine first activates the activated meningococcal polysaccharide and then reactivates with RSV immunogenicity. The conjugated vaccine prepared by the method takes RSV immunogenic protein and meningococcal polysaccharide as antigen and meningococcal recombinant protein as polysaccharide carrier protein. The recombinant protein comprises recombinant fHbp, flexible ligation peptide segment and NadA, and the recombinant fH H BP includes fHbp, variant V1's VA, VB domain and fHbp variant V3 VC, VD, VE domain.

【技术实现步骤摘要】
抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法
本专利技术涉及一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法，属于生物
，尤其是生物医药领域。
技术介绍
一、呼吸道合胞病毒及其流行病学呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而流感病毒(Influenzavirus，FLU)和呼吸道合胞病毒(RespiratorySyncytialVirus，RSV)则是重要的呼吸道病原体。目前，流感已有安全有效的不同类型疫苗，为流感的防控提供了保证。而RSV由于自身免疫特性，尚无有效的疫苗可用。RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和因肺炎死亡的重要原因。据统计，6个月以内的婴幼儿因RSV感染导致住院率达70％，2周岁以内的儿童感染率甚至高达99％。RSV因其致病范围广，病情高发，且会引起严重的并发症等，给人类健康和生命安全造成了严重威胁。世界卫生组织已将RSV疫苗定为优先发展的疫苗之一。RSV隶属于副粘病毒科肺病毒属，是单股负链RNA病毒。RSV基因组全长约15Kb，编码10种主要蛋白，包括三个跨膜蛋白(G、F和SH)、两个基质蛋白(M和M2)、三个核衣壳蛋白(N、P和L)及两个非结构蛋白(NS1和NS2)构成，其中融合蛋白F(Fusionprotein，F)和附着蛋白G(Attchmentprotein，G)是RSV激发机体产生保护性抗体最重要的病毒蛋白。G蛋白高度差异，根据G蛋白抗原性差异RSV可分为A和B两个亚型；RSV的F蛋白高度保守，介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，使得病毒成功入侵宿主细胞并且还可引起相邻细胞质膜间的融合促进体外合胞体的形成。针对RSVF和G糖蛋白的中和抗体能有效防止RSV再感染，因此RSVF和G蛋白已被公认为RSV的毒力致病分子和保护性抗原。对于RSV而言，20世纪60年代，FμLginitiVA等研制的福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)由于诱发Th2型免疫过激导致2名儿童死亡，以失败告终。目前RSV疫苗的研究主要集中在载体疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗，但至今无获批的RSV疫苗可用。RSV疫苗的研究一直是国际社会关注的焦点，从已有的研制中的RSV疫苗可见，注射免疫不能产生有效的粘膜和细胞免疫反应且免疫保护效果受限、DNA疫苗存在潜在安全性以及全长F、G蛋白疫苗存在潜在Th1/Th2失平衡等瓶颈问题亟待解决。阻碍RSV疫苗研制的主要障碍有以下几点：一是大多数动物模型包括黑猩猩等均为半敏感感染/复制模型，因此难以完全再现RSV的致病性；二是作为疫苗主要目标人群的新生儿免疫系统发育不成熟，同时体内存在的母传抗体能介导免疫干扰；三是RSV存在两种不同抗原亚型，而且自然感染难以产生有效的免疫保护作用；四是福尔马林灭活疫苗(FI-RSV)不仅不能防止婴幼儿感染，在之后的自然感染中，接种疫苗的儿童病情加重(即疾病增强作用)、甚至死亡。近年来的研究表明，以载体为基础构建的RSV疫苗有望用于新生儿。载体疫苗主要包括病毒载体疫苗和细菌载体疫苗。RSV病毒载体疫苗主要包括：痘苗病毒(vacciniavirus)载体疫苗、腺病毒(adenovirus，Ad)载体及副黏病毒(paramyxovirus)载体疫苗等，近年来，腺病毒载体疫苗和副黏病毒载体疫苗受到广泛关注。二、脑膜炎奈瑟氏菌(Nm)及其流行病学流行性脑脊髓膜炎(epidemiccerebrospinalmeningitis)是由脑膜炎奈瑟氏菌，通过呼吸道传播引起的急性化脓性脑膜炎，在世界各地均有不同程度的流行。脑膜炎奈瑟菌也称为脑膜炎球菌，是一类革兰染色阴性双球菌，通常定植在人的鼻咽部。人类是其唯一宿主，因而Nm表现出对人类鼻咽部高度的适应性，10％-40％的健康人群都是Nm的无临床症状携带者，在脑膜炎爆发性流行时期，无症状携带者比例更可高达70％。少数情况下，Nm可经血侵入脑脊髓膜，引起化脓性炎症，出现脑膜刺激症和化脓性脑膜炎的脑脊液变化。疫苗预防是防治脑膜炎球菌病的重要手段，因为即使采用抗生素干涉，这种疾病仍有高发病率和死亡率。具有致病性的Nm菌株一般都具有荚膜结构，健康人群正常携带的菌株往往会缺失荚膜，成为不能分群的菌株。根据Nm荚膜多糖的化学组成可将其分成A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和w13513个血清群(Serogroup)，而根据其外膜蛋白(OMP)、PorB(2或3类OMp)和PorA(1类OMP)的抗原性差异，又可分成不同的血清型和血清亚型。全球每年约发生120万的Nm感染病例，多数病例是由A、B、C、W135、Y群菌株引起。而在发达国家中由B群Nm引起的流行性脑脊髓膜炎病例更是高达总病例的80％。在我国的流行主要以A群为主，近年来由于疫苗的广泛接种，A群引起的感染得到有效控制，而由B群引起的病例也相对增多。单一血清群、血清型和血清亚型的流脑菌苗在整体上很难预防流行性脑脊髓膜炎的发生。随着对Nm表面抗原结构更加深入的研究，流脑菌苗正朝着多元化方向发展。流脑多糖-蛋白缀合菌苗已有研制，Chiron和Wyem使用脱毒白喉类毒素(CRM197)作为蛋白载体，Baxter用破伤风类毒素作为载体，开发了A/C群脑膜炎球菌缀合疫苗，于1999年11月引入了英国。此后Sanofi-Pasteur开发了A/C/Y/W135群多糖共价结合白喉类毒素(MCV4)的四价缀合疫苗，我国已有几种A、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白TT的缀合疫苗批准上市。由于脑膜炎球菌多糖及缀合疫苗应用，有效的预防了A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的感染。与A、C、W135、Y群菌株荚膜多糖不同，B群Nm菌株的荚膜多糖免疫原性较低，并且MenB荚膜多糖的结构与正在发育的神经组织及少数成熟组织中的神经细胞黏附分子同源，免疫接种易产生自身免疫。因此，B群Nm的荚膜多糖不能用作疫苗的抗原成份。B群疫苗的研究目前主要集中在非荚膜抗原，如蛋白、脂多糖(1ipopolysaccharide，LOS)等。筛选非荚膜表面抗原的主要挑战是其安全性、抗原保守性及能引发广泛有效的杀菌力反应。能作为候选疫苗的具有免疫原性的蛋白质需具备以下特点：在大多数菌株中都表达且结构保守；可诱生杀菌抗体或保护性抗体。目前在蛋白质疫苗的研究方面取得了一定进展，诺华公司应用反向疫苗学研制的4CMenB疫苗已通过Ⅲ期临床实验。在研热点候选抗原有PorA，NhhA、GNA2132、NadA和fHBP等，其中fHBP是最有前途的候选蛋白质之一。fHBP为因子H结合蛋白(FactorH-bindingProtein，fHBP)，又称为脂蛋白2086，几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面，由255个氨基酸残基组成，分子量29000。因子H是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用。也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fHBP和因子H结合可下调替代途径，从而有利于脑膜炎奈瑟菌生存。fHBP对于脑膜炎球菌在人类的血液、血清和抗菌性多肽存在的情况下的生存是极为重要的。其氨基酸序列较保守，变种内91.6％-100％氨基酸相同。重组fHBP抗体可引起针对同一类变种的补体介导的杀菌作用和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连。

【技术特征摘要】
2017.03.22 CN 2017101750028;2017.05.27 CN 201710391.一种抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法用于制备包括RSV免疫原性蛋白、脑膜炎球菌多糖和脑膜炎球菌载体蛋白的缀合疫苗，所述缀合疫苗先将活化的脑膜炎球菌多糖活化后与RSV免疫原性蛋白相连，缀合后再与脑膜炎球菌载体蛋白相连。2.根据权利要求1所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：a)活化多糖：通过活化剂在多糖表面形成醛基或羟基；b)RSV免疫原性蛋白缀合：向活化的多糖中加入RSV蛋白冻干粉，磁力搅拌均匀后加入氰基硼氢化钠溶解，反应后洗脱收集多糖-RSV蛋白缀合物；c)脑膜炎球菌蛋白缀合：将步骤b)中收集的多糖-RSV蛋白缀合物超滤浓缩，加入脑膜炎球菌蛋白和氰基硼氢化钠，反应至少48h后加入硼氢化钠，反应后洗脱收集多糖-双蛋白缀合物。3.根据权利要求2所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于，所述活化多糖采用的方式具体为：加入高碘酸盐使多糖上相邻的双羟基氧化为醛基。4.根据权利要求2所述的抗RSV和脑膜炎球菌缀合疫苗的制备方法，其特征在于：RSV免疫原性蛋白缀合和脑膜炎球菌蛋白缀合在洗脱前，加入硫酸铵溶液平衡层析柱。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫利明，刘昊智，李津，吴克，
申请(专利权)人：武汉博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42