基于CRISPR的基因组修饰和调控制造技术

本发明专利技术提供经工程改造用于在真核细胞或胚胎中表达的RNA指导的核酸内切酶，和在真核细胞或胚胎中将RNA指导的核酸内切酶用于靶基因组修饰的方法。也提供融合蛋白，其中各融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域。效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。也提供使用融合蛋白修饰染色体序列或调控染色体序列表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR的基因组修饰和调控本申请是申请日为2013年12月5日，申请号为201380072477.4，专利技术名称为“基于CRISPR的基因组修饰和调控”的专利技术专利的分案申请。
本公开内容涉及靶基因组修饰。具体而言，本公开涉及RNA指导的核酸内切酶或包含CRISPR/Cas样蛋白的融合蛋白和使用所述蛋白修饰修饰或调控靶染色体序列的方法。专利技术背景靶基因组修饰是用于真核细胞、胚胎和动物的基因操作的有力的工具。例如，外源序列可以被整合在靶基因组位置和/或特定的内源染色体序列可以被缺失、失活或修饰。当前的方法依赖于工程化核酸酶的使用，工程化核酸酶例如，锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活子样效应子核酸酶(TALENs)。这些嵌合核酸酶含有与非特异性DNA剪切结构域连接的可编程的、序列特异性的DNA结合组件。但是，各个新的基因组靶需要设计包含新的序列特异性的DNA-结合组件的新ZFN或TALEN。因此，这些用户定制设计的核酸酶往往制备昂贵且耗时。此外，ZFNs和TALENS的特异性使得它们能介导脱靶剪切。因此，需要不要求针对每个新的靶基因组位置设计新的核酸酶的靶基因组修饰技术。另外，需要特异性增加的具有很少或没有脱靶作用的技术。专利技术概述在本公开内容的不同方面之中提供分离的RNA指导的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用以将核酸内切酶靶向用于剪切的特定核苷酸序列的结构域。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述核酸内切酶可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在其它实施方案中，所述核酸内切酶可进一步包含细胞穿透结构域、标志物结构域，或二者。在进一步的实施方案中，所述核酸内切酶可以是包含指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。在一些情况下，所述指导RNA可以是包含与靶位点互补的5’区域的单分子。也提供编码任一本文公开的RNA指导的核酸内切酶的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸可以是针对在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中翻译而最优化的密码子。在其它实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的核酸序列可以与启动子控制序列可操作性地连接，并任选地可以是载体的一部分。在其它实施方案中，包含可以与启动子控制序列可操作性地连接的编码RNA指导的核酸内切酶的序列的载体也可包含可以与启动子控制序列可操作性连接的编码指导RNA的序列。本专利技术的另一方面包括用于在真核细胞或胚胎中修饰染色体序列的方法。该方法包括向真核细胞或胚胎中引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种如本文所定义的RNA指导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，和任选(iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷酸。该方法进一步包括培养所述细胞或胚胎以便各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入所述靶位点，并且所述双链断裂通过DNA修复过程而修复以便修饰染色体序列。在一个实施方案中，所述RNA指导的核酸内切酶可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，编码引入细胞或胚胎中的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是mRNA。在进一步的实施方案中，其中编码引入细胞或胚胎的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是DNA。在进一步的实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的DNA可以是另外包含编码指导RNA的序列的载体的一部分。在某些实施方案中，所述真核细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是非人单细胞动物胚胎。本公开内容的另外方面提供包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域的融合蛋白。一般而言，所述融合蛋白包含至少一个核定位信号。融合蛋白的效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在一个实施方案中，融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在一个重复中，所述Cas9蛋白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在备选的重复中，所述Cas9蛋白可以被修饰而缺失全部核酸酶活性。在一个实施方案中，所述效应子结构域可以是剪切结构域，例如，FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在另一实施方案中，一种融合蛋白可与另一融合蛋白形成二聚体。所述二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体。在另一实施方案中，所述融合蛋白可与锌指核酸酶形成异源二聚体，其中融合蛋白和锌指核酸酶二者的剪切结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域是FokI核酸内切酶结构域或修饰的FokI核酸内切酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白包含衍生自经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白的CRISPR/Cas样蛋白，并且所述效应子结构域可以是表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。在另外的实施方案中，本文公开的融合蛋白中任一种可包含至少一个选自核定位信号、细胞穿透结构域和标志物结构域的另外的结构域。也提供编码本文提供的融合蛋白中任一种的分离的核酸。本公开内容的仍另一方面包括用于在细胞或胚胎中修饰染色体序列或调控染色体序列的表达的方法。所述方法包括向细胞或胚胎中引入：(a)至少一种融合蛋白或编码至少一种融合蛋白的核酸，其中所述融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域，和(b)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，其中所述指导RNA将融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白指导至染色体序列中的靶位点，并且融合蛋白的效应子结构域修饰染色体序列或调控染色体序列的表达。在一个实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在仍另一实施方案中，所述融合蛋白的CRISPR/Cas样蛋白可经修饰而缺失全部核酸酶活性。在其中融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的一个实施方案中，该方法可包括向所述细胞或胚胎引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸和两种指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中一个双链断裂被引入染色体序列。在其中所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的另一实施方案中，所述方法可包括向所述细胞或胚胎中引入两种融合蛋白或编码两种融合蛋白的核酸和两种指导RNA或编码两种指导RNA的DNA，并且其中两个双链断裂被引入所述染色体序列。在其中所述融合蛋白包含经修饰而缺失全部核酸酶活性的Cas9蛋白和FokI剪切结构域或修饰的FokI剪切结构域的仍另一实施方案中，所述方法可包括向细胞或胚胎中引入一种融合蛋白或编码一种融合蛋白的核酸、一种指导RNA或编码一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其包含：指导RNA，其包含：(i)与真核生物染色体序列中的靶位点互补的第一区域，所述第一区域可与靶位点碱基配对，所述第一区域包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸，(ii)形成茎和环结构的第二区域，和(iii)基本单链的第三区域，其中(i)、(ii)和(iii)以5'至3'方向排列，并且指导RNA包含两个分开的分子，其中在指导RNA和II型CRISPR/Cas9蛋白之间形成蛋白‑RNA复合物，其进一步包含核定位信号，并且通过指导RNA、II型CRISPR/Cas9蛋白和靶位点之间的相互作用将蛋白‑RNA复合物指导至靶位点。

【技术特征摘要】
2012.12.06 US 61/734256;2013.01.30 US 61/758624;201.一种工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其包含：指导RNA，其包含：(i)与真核生物染色体序列中的靶位点互补的第一区域，所述第一区域可与靶位点碱基配对，所述第一区域包含约10个核苷酸至超过约25个核苷酸，(ii)形成茎和环结构的第二区域，和(iii)基本单链的第三区域，其中(i)、(ii)和(iii)以5'至3'方向排列，并且指导RNA包含两个分开的分子，其中在指导RNA和II型CRISPR/Cas9蛋白之间形成蛋白-RNA复合物，其进一步包含核定位信号，并且通过指导RNA、II型CRISPR/Cas9蛋白和靶位点之间的相互作用将蛋白-RNA复合物指导至靶位点。2.权利要求1的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二区域的长度为约16个至约60个核苷酸。3.权利要求1或2的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第三区域的长度为约5个至约60个核苷酸。4.权利要求1至3中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第一分子包含指导RNA的第一区域和指导RNA的第二区域的茎的一半。5.权利要求1至4中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中指导RNA的第二分子包含指导RNA的第二区域的茎的另一半和指导RNA的第三区域。6.权利要求1至5中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白仅包含一个功能性核酸酶结构域。7.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性RuvC样结构域。8.权利要求6的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白包含非功能性HNH样结构域。9.权利要求1至8中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自链球菌物种。10.权利要求9的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中II型CRISPR/Cas9蛋白来自酿脓链球菌。11.权利要求1至10中任一项的工程化RNA指导的核酸内切酶复合物，其中I...

【专利技术属性】
技术研发人员：F陈，GD戴维斯，
申请(专利权)人：西格马奥尔德里奇有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US