用于蛋白纯化的方法技术

本发明专利技术提供了一种用于制备具有降低的抗体还原相关的杂质水平的抗体或其片段的方法。

Method for protein purification

The present invention provides a method for preparing antibodies or fragments with reduced levels of impurities associated with antibody reduction.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于蛋白纯化的方法专利技术背景在治疗领域中，蛋白质和抗体以及特别是抗体衍生的分子的使用一直在不断地增加和突显重要性，因此对受控制造过程的需求也在同时发展。治疗性蛋白的商业化要求大量生产它们。为此目的，经常将所述蛋白在宿主细胞中表达，且必须随后回收和纯化，然后将它制成可施用的形式。在所述纯化过程中除去的杂质通常归类为方法相关的杂质(包括宿主细胞碎片、宿主细胞蛋白、痕量培养基等)和产物相关的杂质(其源自期望的产物的修饰、降解或聚集)。最常见的一类抗体分子是免疫球蛋白G(IgG)，即由2个重链和2个轻链组成的异四聚体。所述IgG分子可以细分成两个功能亚基：(1)可结晶的片段(Fc)，其构成抗体的尾巴并与细胞表面受体相互作用以活化免疫应答，和(2)抗原结合片段(Fab)，其介导抗原识别。所述Fc区域包含来自两个成对重链的两对恒定结构域(CH2和CH3)，而所述Fab区域由来自重链的可变结构域和随后的恒定结构域(分别VH和CH1)组成，它们与来自轻链的可变结构域和恒定结构域(分别VL和CL)配对。所述Fc和Fab区域被铰链区分开，所述铰链区含有将两个重链保持在一起的二硫键；在CH1和CL结构域内的其它二硫键将所述重链和轻链配对在一起。IgG类的全长抗体在传统上已经使用包括亲和色谱法的捕获步骤的方法来纯化，所述亲和色谱法使用从金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)衍生出的蛋白A。蛋白A和抗体的Fc-区域之间的结合的高特异性使得该色谱法模式能够直接从复杂溶液(诸如细胞培养物收获培养基)开始在单个步骤中除去超过98％的杂质。从该方法步骤得到的大纯化因子(purificationfactor)有助于简化整个下游纯化过程。一般而言，仅痕量杂质诸如高分子量聚集体、残余的宿主细胞蛋白、残余的DNA或浸出的蛋白A有待在该纯化步骤以后除去，且这经常可以在1-2个后续色谱步骤中实现。尽管事实上在过去的数十年中已经使用和开发了基于蛋白A的抗体纯化，但是在工业规模制备具有适合施用的纯度水平的重组抗体仍然是一个挑战。具体地，蛋白诸如抗体及其片段包含链间二硫键，其通常需要在制备和纯化过程中保护和维持，以便产生处于它们的天然构象从而保留它们的生物活性的抗体。在这些链间二硫键受环境影响且变得还原的情况下，不同的多肽链将分离，从而产生一类由不完全抗体分子组成的杂质，其必须从最终的抗体制品除去。随着环境在纯化过程中后来变成氧化性的，这些还原相关的杂质可能不正确地改造(reform)，从而导致增加的产物相关的高和低分子量物质水平。产生的另外杂质的纯化导致降低的过程收率和在最终的药用物质中增加的杂质水平。此外，必须确保在制造批次之间的再现性，因此控制这样的杂质的存在和相对量是避免特定制造批次的失败所必需的。批次失败可以是由于药用物质(drugsubstance)中增加的杂质水平，或没有满足过程中(in-process)控制。药用物质中增加的杂质水平也可能降低药物产品的贮存期限。在抗体制备过程中，在蛋白A色谱法步骤以后已经观察到产物相关的杂质(诸如游离重链和轻链、半聚体(halfmer)(一个重链和一个轻链)或由于链间二硫键的还原部分地缺少二硫键的同种型(isoform))的出现。必须避免这些杂质在纯化过程中的出现，和所述杂质作为所述过程的部分而除去。可以通过非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析可能的产物相关的杂质并显示在图1中。在该意义上，US8,574,869公开了用于在从宿主细胞培养物收获重组蛋白过程中阻止二硫键还原的方法。因此，本领域中仍然需要可再现的蛋白制备方法，其允许在不同批次之间以一致的纯度纯化处于它们的天然构象的蛋白。附图说明图1：考马斯染色的非还原凝胶电泳，其显示了从经历纯化以后的抗体样品回收的可能的产物相关的杂质。图2：分子A的蛋白A洗脱液样品的非还原生物分析。所述样品是来自制备活动2批次1和批次2(分别C2B1和C2B2)(没有使用炭过滤器(carbonfilter))和活动3批次1(C3B1)(其中应用炭过滤器)的蛋白A洗脱液样品。在批次2样品中看到的半聚体在批次3样品中没有见到。图3：包括炭过滤(carbonfiltration)的纯化过程流程图。在深度过滤和无菌过滤器(sterilefilter)之间在线(inline)应用活性炭过滤器(activatedcarbonfilter)步骤。它之后是使用蛋白A的捕获步骤，和后续纯化步骤：阴离子交换色谱法(AEX)、阳离子交换色谱法(CEX)、病毒减少过滤(VRF)和配制。图4：IgG分子B制备样品的非还原生物分析。显示的样品是批次1的澄清的细胞培养液和捕获洗脱液(在蛋白A色谱法以后)，其中将所述抗体还原，从而形成半聚体和游离重链。也显示了批次3的捕获洗脱液，其中已经在初次回收中应用活性炭过滤器，且抗体分子在蛋白A捕获步骤以后仍然是单体。图5：分子B的制备样品的Sypro染色的非还原SDS-PAGE分析。泳道1：分子量标准，泳道2：分子1参比标准，泳道3：活动1批次1细胞培养液，泳道4：活动1批次2炭过滤器前，泳道5：活动1批次2炭过滤器后，泳道6：活动1批次1捕获洗脱液，泳道7：活动1批次2无炭过滤器捕获洗脱液，泳道8：活动1批次2炭过滤器后捕获洗脱液。图6：关于还原剂硫氧还蛋白(A)、NAD/NADH(B)和NADP/NADPH(C)测定的、具有深度和无菌过滤(sterilefiltration)(对照)和在深度和无菌过滤器之间引入炭过滤器以后的分子A澄清的细胞培养液(CCCF)。图7：关于还原剂NAD/NADH和NADP/NADPH测定的、来自批次1(在引入炭过滤器之前，对照)和批次2(在炭过滤器应用以后)的分子B澄清的细胞培养液(CCCF)。专利技术详述本专利技术通过提供新的抗体制备方法解决了上面指出的需要，所述方法允许回收具有天然二硫键的抗体，从而提高过程收率和确保批次之间的一致性。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种用于制备抗体或其片段的方法，所述方法包括：-在宿主细胞中表达所述抗体或其片段-回收含有所述抗体或其片段、宿主细胞碎片和杂质的混合物；和-从所述混合物纯化所述抗体或其片段，其中所述纯化包括：-活性炭过滤，继之以-蛋白A色谱法。在第二方面，本专利技术提供了一种用于在纯化在宿主细胞中表达的抗体或其片段的过程中阻止二硫键还原的方法，所述方法包括：-活性炭过滤，继之以-蛋白A色谱法。在第三方面，本专利技术提供了一种用于纯化抗体或其片段的方法，所述方法包括：-活性炭过滤，继之以-蛋白A色谱法。在第四方面，本专利技术提供了一种用于在纯化抗体或其抗体片段的过程中减少还原剂的量的方法，所述方法包括：-活性炭过滤，继之以-蛋白A色谱法。还原剂(reducingagent)(在本领域中也被称作还原剂(reductant)或还原剂(reducer))是在氧化还原化学反应中向另一种化学物质丢失(或贡献)电子的元素或化合物。由于还原剂丢失电子，认为它已经被氧化。某些还原剂(例如钙)可以存在于细胞培养基中，其它还原剂可以作为宿主细胞代谢的结果分泌进细胞培养液中。并且，在重组蛋白制备过程中，由于剪切力和随后的细胞损伤和可能的裂解和/或细胞凋亡(其将细胞组分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于制备抗体或其片段的方法，所述方法包括：‑在宿主细胞中表达所述抗体或其片段‑回收含有所述抗体或其片段、宿主细胞碎片和杂质的混合物；和‑从所述混合物纯化所述抗体或其片段，其中所述纯化包括：‑活性炭过滤，继之以‑蛋白A色谱法。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.01 GB 1605562.61.用于制备抗体或其片段的方法，所述方法包括：-在宿主细胞中表达所述抗体或其片段-回收含有所述抗体或其片段、宿主细胞碎片和杂质的混合物；和-从所述混合物纯化所述抗体或其片段，其中所述纯化包括：-活性炭过滤，继之以-蛋白A色谱法。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括至少一个另外的色谱法步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述另外的色谱法步骤包含阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。4.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然二硫键。5.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述回收的抗体或其片段包含天然链间二硫键。6.根据任意前述权利要求所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，且含有所述抗体的混合物是细胞培养物上清液。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述纯化过程另外包括在活性炭过滤之前的细胞培养物上清液的深度过滤。8.根据权利要求7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·琼斯，J·西蒙斯，S·霍金，
申请(专利权)人：UCB生物制药私人有限公司，
类型：发明
国别省市：比利时,BE