一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用技术

本发明专利技术提供了一种利用光合细菌合成3‑羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用，本发明专利技术旨在通过构建3‑羟基丙酸新的合成途径，通过在光合细菌R.pal中表达外源的丙二酸单酰辅酶A还原酶基因，建立一条新的生物合成3‑羟基丙酸的方法，从而获得含有本体丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB、外源丙二酸单酰辅酶A还原酶C段及丙二酸单酰辅酶A还原酶N段对应的编码基因的重组细胞，同时由本体表达的NAD(P)转氢酶PntAB和外源NAD(+)激酶YfjB的表达辅以还原力NADPH的供应。该重组细胞能够以丙二酸盐为底物合成3‑羟基丙酸，从而建立一条新的更为简短高效的生物催化生产3‑羟基丙酸的方法。

A METHOD FOR SYNTHESIS OF 3-HYDROXYPROPIONIC ACID BY PHOTOSYNTHETIC BACTERIA AND ITS RECOMBINANT CELLS AND APPLICATIONS

The present invention provides a method for synthesizing 3 hydroxypropionic acid by photosynthetic bacteria and corresponding recombinant cells and applications. The aim of the present invention is to establish a new biosynthetic 3 hydroxypropionic acid by constructing a new synthetic pathway of 3 hydroxypropionic acid and expressing an exogenous malonate monoacyl coenzyme A reductase gene in photosynthetic bacteria R.pal. Propionic acid method was used to obtain recombinant cells containing the corresponding coding genes of propanoic acid monoacyl coenzyme A synthase MatB, exogenous propanoic acid monoacyl coenzyme A reductase C segment and propanoic acid monoacyl coenzyme A reductase N segment. At the same time, the expression of NAD(P) transhydrogenase PntAB and exogenous NAD(+) kinase YfjB was complemented by the reductive force NADPH. Supply. The recombinant cells were able to synthesize 3 hydroxypropionic acid using malonate as a substrate, thus establishing a new and more efficient method for biocatalytic production of 3 hydroxypropionic acid.

【技术实现步骤摘要】
一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用。
技术介绍
3-羟基丙酸(3-HP)是一种重要的平台化合物，可作为可降解塑料的聚合单体；因其具有显著的市场价值和应用前景，于2004年被美国能源部列为12种最重要的生物基化学品之一。3-HP可以通过化学合成法和生物合成法获得。传统的化学合成法普遍存在原材料价格昂贵、毒性较大等缺陷，另一方面，其催化效率和选择性也较低，不能满足工业化应用的要求。然而，生物合成法则可以利用廉价的生物质资源进行生产，具有反应条件温和、操作简单、副产物较少、绿色环保、生产成本较低等优点。在资源和环境的双重压力下，生物法合成3-HP已经引起越来越多的兴趣，近年来发展迅速，取得了一系列进展。目前，3-HP的合成主要有天然合成和代谢工程合成两大途径，尤以利用甘油、葡萄糖等廉价碳源合成3-HP的代谢工程研究发展迅速，已逐渐成为高效合成3-HP的重要手段。其中，以甘油为底物的途径包括辅酶A依赖型和非辅酶A依赖型两条途径；以葡萄糖为底物的途径中包含丙酸途径、乳酸途径、β-丙氨酸途径、草酰乙酸途径和丙二酸单酰辅酶A途径。丙二酸单酰辅酶A途径是已知的以葡萄糖为碳源合成3-羟基丙酸的最短途径，也是目前研究最深入的途径，本专利技术即基于该途径建立的一条新途径，进一步缩短了其代谢途径。微生物具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此微生物作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供了一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法及其相应重组细胞和应用，本专利技术对传统丙二酸单酰辅酶A途径进行改造，建立一条合成3-羟基丙酸新代谢途径的方法，在重组细胞体内，通过本体表达丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB结合利用基因工程手段异源表达丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR，同时通过本体表达NAD(P)转氢酶PntAB结合异源表达NAD(+)激酶YfjB辅以还原力的的补充，将丙二酸盐转化为目标产物3-羟基丙酸，从而建立一条新的3-羟基丙酸生物合成途径。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，它包括以下步骤：(1)分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；(2)构建载体pJQ200SK-mcrC/matA分别扩增matA基因编码序列上下游的同源臂matA-up和matA-down，扩增mcrC基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的matA-up、mcrC和matA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrC/matA；(3)构建载体pJQ200SK-mcrN/lldA分别扩增lldA基因编码序列上下游的同源臂lldA-up和lldA-down，扩增mcrN基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的lldA-up、mcrN和lldA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrN/lldA；(4)构建载体pJQ200SK-yfjB/RPA3450分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450-up和RPA3450-down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的RPA3450-up、yfjB和RPA3450-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450；(5)将包含pJQ200SK-mcrC/matA质粒的大肠杆菌与R.palCGA009进行接合，筛选获得工程菌株R.palCGA009-mcrC/matA；(6)将包含pJQ200SK-mcrN/lldA质粒的大肠杆菌与所述R.palCGA009-mcrC/matA进行接合，筛选获得工程菌株R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA；(7)将包含pJQ200SK-yfjB/RPA3450质粒的大肠杆菌与所述R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA进行接合，筛选获得工程菌株R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450；(8)将活化后的R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450接种到含有丙二酸盐的培养液中培养，光照培养，最终发酵获得3-羟基丙酸。进一步的：所述步骤(8)中R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450按2∶100的比例接种到含有丙二酸盐的培养基中。进一步的：所述步骤(8)中在30℃、光照条件下低速搅拌培养，当OD660不再增长后，继续培养12-24小时。进一步的：所述YfjB基因来源于大肠杆菌。本专利技术还提供了所述合成3-羟基丙酸的方法中获得的重组细胞，所述重组细胞包含mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因和lldA基因。进一步的：所述的重组细胞为光合细菌沼泽红假单胞菌R.palCGA009-mcrC/matA-mcrN/lldA-yfjB/RPA3450。本专利技术还提供了所述的重组细胞在用于制备化合物或组合物中的应用，所述化合物和组合物包括：3-羟基丙酸、异丁醇、异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯嵌段共聚物弹性体和橡胶硫化剂。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益技术效果：本专利技术中利用新丙二酸单酰辅酶A途径合成3-羟基丙酸的方法与传统丙二酸单酰辅酶A途径相比其优点在于：传统的通过丙二酸单酰辅酶A途径合成3-羟基丙酸需要经过多步酶催化反应，首先葡萄糖通过多步转化为乙酰辅酶A，在乙酰辅酶A羧化酶ACC的作用下生成丙二酸单酰辅酶A，进一步在丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR作用下转化为3-HP。而本专利技术则直接以丙二酸盐为底物，直接在丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB作用下生成丙二酸单酰辅酶A，接下来在丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR作用下转化为3-羟基丙酸。(1)本专利技术充分利用光合细菌R.pal本体的丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB，大大缩短了3-羟基丙酸的生物合成途径；(2)本专利技术充分利用了优化的丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR，大大提高了3-羟基丙酸的转化效率；(3)通过本体表达NAD(P)转氢酶PntAB结合异源表达NAD(+)激酶YfjB辅以还原力的的补充，进一步提高了3-羟基丙酸的转化效率；本专利技术主要结合本体表达和通过基因工程的手段，在细胞中本体表达丙二酸单酰辅酶A合成酶MatB和NAD(P)转氢酶PntAB，利用基因工程手段异源表达丙二酸单酰辅酶A还原酶MCR和NAD(+)激酶YfjB，获得的重组细胞含有表达上述酶的基因，该重组细胞能够从丙二酸盐合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用光合细菌合成3‑羟基丙酸的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1) 分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；(2) 构建载体pJQ200SK‑mcrC/matA分别扩增matA 基因编码序列上下游的同源臂matA‑up和matA‑down，扩增mcrC 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的matA‑up、mcrC和matA‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑mcrC/matA；(3) 构建载体pJQ200SK‑mcrN/lldA分别扩增lldA 基因编码序列上下游的同源臂lldA‑up和lldA‑down，扩增mcrN 基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的lldA‑up、mcrN和lldA‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑mcrN/lldA；(4) 构建载体pJQ200SK‑yfjB/RPA3450分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450‑up和RPA3450‑down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的RPA3450‑up、yfjB和RPA3450‑down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK‑yfjB/RPA3450；(5) 将包含pJQ200SK‑mcrC/matA质粒的大肠杆菌与R. pal CGA009进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA；(6) 将包含pJQ200SK‑mcrN/lldA质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009‑mcrC/matA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA；(7) 将包含pJQ200SK‑yfjB/RPA3450质粒的大肠杆菌与所述R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA进行接合，筛选获得工程菌株R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA‑yfjB/RPA3450；(8) 将活化后的R. pal CGA009‑mcrC/matA‑mcrN/lldA‑yfjB/RPA3450接种到含有丙二酸盐的培养液中培养，光照培养，最终发酵获得3‑羟基丙酸。...

【技术特征摘要】
1.一种利用光合细菌合成3-羟基丙酸的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)分别克隆mcrC基因、mcrN基因、YfjB基因、matA基因、lldA基因；(2)构建载体pJQ200SK-mcrC/matA分别扩增matA基因编码序列上下游的同源臂matA-up和matA-down，扩增mcrC基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的matA-up、mcrC和matA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrC/matA；(3)构建载体pJQ200SK-mcrN/lldA分别扩增lldA基因编码序列上下游的同源臂lldA-up和lldA-down，扩增mcrN基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的lldA-up、mcrN和lldA-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-mcrN/lldA；(4)构建载体pJQ200SK-yfjB/RPA3450分别扩增RPA3450基因编码序列上下游的同源臂RPA3450-up和RPA3450-down，扩增yfjB基因；将pJQ200SK质粒使用限制性内切酶PstI进行单切线性化；将纯化后的RPA3450-up、yfjB和RPA3450-down三个片段和线性化后的pJQ200SK混合于反应体系中，在水浴中孵育；产物转化大肠杆菌，获得重组质粒pJQ200SK-yfjB/RPA3450；(5)将包含pJQ200SK-mcrC/matA质粒的大肠杆菌与R.palCGA009进行接合，筛选获得工程菌株R.palCGA009-mcrC/matA；(6)将包含pJQ200SK-mcrN/lldA质粒的大肠...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，王兆宝，孙冠男，梁波，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37