一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，以一株土壤来源的真菌菌株Gongronella sp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲酸。与化学合成法相比，整个反应过程是在常温常压下进行的，污染小、能耗小，并且制备方法简单，不需要酚类物质作为原料；本发明专利技术目标产物纯度大于98％。

A method of synthesizing P hydroxybenzoic acid by microorganism

The invention discloses a method for synthesizing p-hydroxybenzoic acid by microorganism. A soil-derived fungus strain Gongronella sp. W5 is used as a production bacteria to extract and isolate p-hydroxybenzoic acid from its fermentation broth. Compared with the chemical synthesis method, the whole reaction process is carried out under normal temperature and pressure, less pollution, less energy consumption, and the preparation method is simple and does not require phenolic substances as raw materials; the purity of the target product of the invention is more than 98%.

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法
本专利技术涉及一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。
技术介绍
对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoicacid)是一种具有多种用途的有机合成原料，其酯类物质的合成，已在食品药品的防腐杀菌、香精工业、医药合成和农业等领域得到广泛应用。防腐剂方面，对羟基苯甲酸酯(尼泊金酯)是普遍被认可的无刺激安全的化妆品防腐剂；作为食品添加剂，可用于酱油、醋、饮料、果品调味剂、果蔬和腌制品等；亦可用于医药的防腐、防霉和杀菌，是目前应用最广泛的防腐剂之一。香精工业方面，对羟基苯甲酸可用于合成对茴香酸，其酯类呈淡淡的水果及茴香香气，等同天然香料，用于各种香精的配制。药物合成方面，对羟基苯甲酸可用于许多重要药物的合成原料，包括治疗痛风的非布索坦、具有调脂作用的非诺贝特、抗心律失常药胺碘酮和脑功能改善药茴拉西坦等药物的合成。农药合成方面，对羟基苯甲酸可用于除草剂溴苯腈和碘苯腈、杀虫剂杀螟腈和苯腈磷的合成。此外，对羟基苯甲酸还可用于紫外线吸收剂、热敏染料显色剂、彩色胶片、液晶聚合物和塑料的合成。对羟基苯甲酸的生产方法多种多样，化学法如水杨酸钾加热制取、苯酚钾羧化法、又或者是由异丙苯合成苯酚后，再经高温高压的Kolbe-Schmitt反应合成。其合成工艺存在能源消耗大、成本高、产率低等问题，并且合成途径中产生的苯酚对环境有较大污染。从天然植物中提取，则存在周期长、收率低等缺点。
技术实现思路
本专利技术是为了避免上述现有技术所存在的不足之处，旨在提供一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法。本专利技术以一株土壤来源的真菌菌株Gongronellasp.w5为生产菌，从其发酵液中提取分离获得对羟基苯甲酸。该微生物合成法可以在常温常压下进行、并且具有绿色高效等优点。本专利技术利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，包括如下步骤：步骤1：Gongronellasp.w5发酵液的制备1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronellasp.w5保藏斜面上划出一小菌块(1cm×1cm)接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块(1cm×1cm)转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％(V/V)的比例接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；步骤2：Gongronellasp.w5发酵液粗提物的制备将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；步骤3：粗提物的分离将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；步骤4：组分4的分离纯化将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸(w5-4)。步骤1中，所述固体CPDA培养基以1L计组成如下：200g土豆滤出液(200g土豆加400mL蒸馏水煮沸30min，过滤)、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B1以及15g琼脂粉混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。步骤1中，所述Ⅵ液体培养基以1L计组成如下：15g蔗糖、1.5gDL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。步骤1中，所述菌株Gongronellasp.w5是从土壤中分离获得，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2017年12月30日，保藏编号CCTCCNO：M2017787。步骤3中，梯度洗脱的洗脱参数为：设置四个洗脱梯度，洗脱液由二氯甲烷和甲醇按照体积比分别为100:1、100:2、100:4、100:8构成，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析检测，相同部分进行合并，得到组分4。步骤3中硅胶柱进行粗分离的过程具体包括如下步骤：3a、拌样：将粗提物浸膏和硅胶(200-300目)按1:2的比例进行拌样，自然风干后，研磨成细粉末状待用；3b、装柱：称10-50倍于上样量的干硅胶(200-300目)，加入干硅胶体积一倍的二氯甲烷，用玻璃棒充分搅拌成匀浆后，倒入晾干的玻璃柱中，装上蓄液球，打开柱下活塞，使其自然沉降，将沾于壁上的硅胶用起始洗脱剂轻轻冲洗下去(保证硅胶上表面平整即可)；3c、压实：沉降完成后，添加更多的二氯甲烷，直至柱床压实(硅胶上表面高度不在下降)；3d、上样：将以上拌好样的样品缓缓加到压实的硅胶柱上，沿壁缓缓加入一些二氯甲烷，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶上表面，以防止续液时硅胶表面被砸坑；3e、过柱和收集：以二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱(二氯甲烷：甲醇＝100:1、100:2、100:4、100:8)，每个梯度冲两个柱体积，每100mL为一个流份收集，通过薄层层析进行检测，相同部分进行合并，得到组分4。步骤4中，梯度洗脱的洗脱参数为：设置三个洗脱梯度，洗脱液分别为10vt％、15vt％、20vt％的甲醇水溶液，每个梯度洗脱两个柱体积，每100mL收集一个流份，通过薄层层析检测，相同流份进行合并，低温浓缩除去溶剂，即可获得对羟基苯甲酸(w5-4)。将本专利技术制得的化合物w5-4低温蒸干后，加入氘代甲醇溶解，以TMS为内标，AM-400型超导核磁共振仪测定化合物w5-4的核磁谱，包括：1H-NMR、13C-NMR、DEPT135；另将甲醇溶解的样品进行质谱测定。与现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：1、与化学合成法相比，整个反应过程是在常温常压下进行的，污染小、能耗小，并且制备方法简单，不需要酚类物质作为原料。2、Gongronellasp.w5菌株全基因组已测序，保证了其安全性，为其工业化规模生产奠定了理论基础。3、目标产物纯度大于98％。附图说明图1是组分4过ODS反相柱后的TLC图。图2是本专利技术制备的w5-4的MS谱图，图中为ESI电离源负离子模式。图3是本专利技术制备的w5-4的核磁共振氢谱图。图4是本专利技术制备的w5-4的w5-4的核磁共振碳谱图。图5是本专利技术制备的w5-4的核磁共振DEPT135碳谱图。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术技术方案作进一步分析说明。本专利技术利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法如下：1、原料的准备1a、菌株Gongronellasp.w5是从土壤中分离获得，该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2017年12月30日，保藏编号CCTCCNO：M2017787。1b、固体CPDA培养基的制备：将20％土豆滤出液、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B1以及15g琼脂粉混合均匀，然后于115℃灭菌30min，备用。1c、所述Ⅵ液体培养基的制备：将15g蔗糖、1.5gDL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：Gongronella sp.w5发酵液的制备1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronella sp.w5保藏斜面上划出一菌块接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块转接到装有100mL Ⅵ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％的体积比接种到装有400mL Ⅵ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；步骤2：Gongronella sp.w5发酵液粗提物的制备将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；步骤3：粗提物的分离将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；步骤4：组分4的分离纯化将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸。

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物合成对羟基苯甲酸的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：Gongronellasp.w5发酵液的制备1a、菌种活化：在无菌条件下，从菌株Gongronellasp.w5保藏斜面上划出一菌块接种于固体CPDA培养基上，于28℃生化培养箱中培养5天；1b、种子液制备：在无菌条件下，从1a培养好的固体培养基上铲划出四块菌块转接到装有100mLⅥ液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、120rpm摇床中进行培养4天，获得的发酵产物作为种子液；1c、发酵：将1b获得的种子液匀浆打碎，匀浆液按2.5％的体积比接种到装有400mLⅥ液体培养基的1L三角瓶中，37℃、120rpm摇床中培养3天，收集发酵液50L；步骤2：Gongronellasp.w5发酵液粗提物的制备将步骤1收集的50L发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，旋蒸浓缩除去溶剂，获得粗提物浸膏；步骤3：粗提物的分离将步骤2获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，0.22μm滤膜过滤，上硅胶柱进行粗分离，梯度洗脱后得到组分4；步骤4：组分4的分离纯化将步骤3获得的组分4过ODS反相柱，进行梯度洗脱，获得对羟基苯甲酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述固体CPDA培养基以1L计组成如下：200g土豆滤出液、20g葡萄糖、3.0g磷酸二氢钾、1.5g七水硫酸镁、0.04g维生素B1以及15g琼脂粉混合均匀后于115℃灭菌30min后获得。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述土豆滤出液是由200g土豆加400mL蒸馏水煮沸30min后过滤获得。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述Ⅵ液体培养基以1L计组成如下：15g蔗糖、1.5gDL-天冬酰胺、1.0g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、0.1g十二水磷酸氢二钠、0.01g氯化钙、0.01g七水硫酸亚铁、2mg硫酸锌、2mg五水硫酸铜、0.05mg维生素B1以及28mg腺苷酸混合均匀后于115℃灭菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖亚中，胡俊，方泽民，房伟，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34