苯丙素类和苯丙素类衍生物的生物合成制造技术

本文中提供了用于产生苯丙素类化合物和苯丙素类衍生物化合物的重组宿主和方法。发现，来自杀鲑气单胞菌A449(Aeromonas salmonicida A449)的酪氨酸解氨酶提高香豆酸产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】苯丙素类和苯丙素类衍生物的生物合成专利技术背景
本文中公开的专利技术总体上涉及遗传工程领域。特别地，本文中公开的专利技术提供了用于生物合成产生苯丙素类(phenylpropanoid)和苯丙素类衍生物(例如查耳酮和茋)的方法。相关技术说明苯丙素类是植物中由酚类氨基酸前体生物合成产生的多样的酚类化合物家族。苯丙素类及其衍生物具有期望的应用，例如在食品和卫生保健工业中具有期望的应用。一种示例性苯丙素类衍生物是柚皮素，该化合物也是下游苯丙素类衍生物产生中的中间体。柚皮素具有以下化学结构：柚皮素在植物中天然产生，并且还在遗传改造成具有类黄酮生物合成途径组分的细胞中生物合成(参见例如，Koopman等，(2012)MicrobialCellFactories2012，11：155)。例如，将改造成产生香豆酰CoA的细胞进一步改造成具有表达将香豆酰CoA转化成柚皮素的蛋白质的重组基因。另一种示例性苯丙素类衍生物是茋类白藜芦醇，其也是产生其他下游苯丙素类衍生物中的中间体。白藜芦醇具有以下化学结构：白藜芦醇也使用香豆酰CoA前体分子产生。一般来说，茋(包括白藜芦醇)和查耳酮在植物和酵母中通过苯丙素类途径产生，如图1中所示的反应举例说明的并且如U.S.2008/0286844中所述的，其通过引用整体并入本文。在酵母中，起始代谢物是丙二酰CoA和苯丙氨酸或酪氨酸。氨基酸L-苯丙氨酸通过L-苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)的非氧化脱氨被转化成反式-肉桂酸。接着，反式-肉桂酸通过肉桂酸-4-羟化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、细胞色素P450单加氧酶并联合NADPH：细胞色素P450还原酶(cytochromeP450reductase，CPR)在对位被羟基化成4-香豆酸(4-羟基肉桂酸)。或者，氨基酸L-酪氨酸通过酪氨酸解氨酶(tyrosineammonialyase，TAL)直接转化成4-香豆酸。来自任一途径的4-香豆酸随后通过4-香豆酸-CoA连接酶(4-coumarate-CoAligase，4CL)的作用被激活成4-香豆酰CoA。在苯丙素类途径中，4-香豆酰CoA代表由其衍生苯丙素类衍生物(包括查耳酮和茋)的关键分支点。茋通过也称为白藜芦醇合酶(resveratrolsynthase，RS)的茋合酶(stilbenesynthase，STS)合成，所述酶催化4-香豆酰CoA的苯丙烷单元与丙二酰CoA缩合，使得形成白藜芦醇。反之，查耳酮通过4-香豆酰CoA的苯丙烷单元与丙二酰CoA的缩合和查耳酮合酶(chalconesynthase，CHS)合成，使得形成四羟基查耳酮。当前产生柚皮素、白藜芦醇和其他苯丙素类衍生物的方法由于竞争苯丙素类(例如香豆酰CoA)作为底物的途径而受到限制。例如，改造成产生柚皮素的细胞还通过未知的机制产生根皮酸(参见例如，Koopman等，(2012)MicrobialCellFactories2012，11：155)。根皮酸是苯丙素类途径的一种副产物。其是一种二氢-苯丙素类，由苯丙素类(例如，对香豆酰CoA)转化成二氢苯丙素类(例如，对二氢香豆酰CoA)。然而，负责产生二氢苯丙素类(并降低柚皮素产生)的酶目前尚不知晓。将L-苯丙氨酸转化成氨和反式-肉桂酸的苯丙氨酸解氨酶(PAL)以及将L-酪氨酸转化成对香豆酸的酪氨酸解氨酶(TAL)二者都是芳族氨基酸裂解酶家族的成员。芳族氨基酸裂解酶家族的第三成员是将组氨酸转化成反式-尿刊酸的组氨酸解氨酶(histidineammonialyase，HAL)。大部分的解氨酶对苯丙氨酸和酪氨酸二者都具有亲和力，其中对苯丙氨酸具有较强的优先性。这些酶称为PAL/TAL。Watts，K.T.等(2006)鉴定了负责底物特异性的单活性位点残基，并且报道在类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)TAL中用Phe替换活性位点残基His89将其底物选择性从酪氨酸转变成苯丙氨酸(Watts，K.T.等(2006)Chemistry&Biology13，1317-1326)。一般来说，与TAL相比，PAL是活性更高的酶并且因此已被优先用于在酵母菌株(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))中产生苯丙素类(参见例如U.S.专利No.8,895,287)。然而，发现并在产生苯丙素类和苯丙素类衍生物的菌株(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))中引入活性的特异性TAL可使得显著提高通过苯丙素类途径的碳通量，并且因此提高苯丙素类或苯丙素类衍生物(包括查耳酮和茋)的产生。已报道了通过使用PAL和TAL二者来表达异源苯丙素类途径(参见Koopman，F.等，2012，MicrobialCellFactories，11：155)。Koopman，F.等(2012)(同上)使用来自荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)的TAL(RcTAL)。然而，甚至在去调节芳族氨基酸的合成从而增加可利用酪氨酸之后，RcTAL仍表现出非常差的活性并且因此不能够在工业应用中使用。因此，仍然需要在酵母中表达产生高产率苯丙素类或苯丙素类衍生物的活性特异性TAL。专利技术概述针对上述背景，本专利技术相对于现有技术提供了某些优点和进步。尽管本文中公开的本专利技术不限于特定的优点或功能，但是本文中公开的专利技术提供了一种重组宿主，其包含编码酪氨酸解氨酶(TAL)多肽的重组基因，其中所述宿主能够产生苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物，并且其中所述TAL多肽使用酪氨酸作为优选底物。本专利技术还提供了产生苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物的方法，其包括在其中表达重组基因的条件下，在培养基中培养如本文中所述的重组宿主，其中苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物通过所述重组宿主合成。在一些方面，编码TAL多肽的基因编码具有SEQIDNO：31所示的氨基酸序列的多肽。在一些方面，编码TAL多肽的基因编码与SEQIDNO：31所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。在一些方面，编码TAL多肽的基因在重组宿主中过表达。在一些方面，与不包含编码TAL多肽的基因的重组宿主相比，包含TAL基因的重组宿主能够产生产率提高的苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物。在一些方面，与不包含编码TAL多肽的基因的重组宿主相比，包含TAL基因的重组宿主产生产率提高的苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物。在一些方面，与不包含编码所述TAL多肽的基因的重组宿主相比，包含TAL基因的重组宿主产生产率提高的以下一种或更多种：(1)白藜芦醇和(2)香豆酸。在本文中公开的重组宿主或方法的一些方面，所述重组宿主还包含编码以下的重组基因：(a)茋合酶(STS)多肽；或(b)查耳酮合酶(CHS)多肽。在本文中公开的重组宿主或方法的一些方面，所述重组宿主还包含以下一种或更多种：(a)编码L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽的基因；(b)编码肉桂酸-4-羟化酶(C4H)多肽的基因；(c)编码NADPH：细胞色素P450还原酶多肽的基因；(d)编码4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)多肽的基因；或(e)编码查耳酮异构酶(CHI)多肽的基因，其中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组宿主，其包含编码酪氨酸解氨酶(TAL)多肽的重组基因，其中所述宿主能够产生苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物，并且其中所述TAL多肽使用酪氨酸作为优选底物.

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.28 US 62/167,5951.一种重组宿主，其包含编码酪氨酸解氨酶(TAL)多肽的重组基因，其中所述宿主能够产生苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物，并且其中所述TAL多肽使用酪氨酸作为优选底物.2.根据权利要求1所述的宿主，其中编码TAL多肽的所述基因编码具有SEQIDNO：31所示的氨基酸序列的多肽.3.根据权利要求1所述的宿主，其中编码TAL多肽的所述基因编码与SEQIDNO：31所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽.4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主，其中编码所述TAL多肽的所述基因被过表达.5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主，其中与不包含TAL基因的重组宿主相比，所述重组宿主能够产生产率提高的苯丙素类化合物或苯丙素类衍生物化合物.6.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主，其还包含编码以下的重组基因：(a)茋合酶(STS)多肽；或(b)查耳酮合酶(CHS)多肽.7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主，其还包含以下一种或更多种：(a)编码L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)多肽的基因；(b)编码肉桂酸-4-羟化酶(C4H)多肽的基因；(c)编码NADPH：细胞色素P450还原酶多肽的基因；(d)编码4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)多肽的基因；或(e)编码查耳酮异构酶(CHI)多肽的基因，其中所述基因中至少一种是重组基因.8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主，其中所述苯丙素类化合物是香豆酸.9.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主，其中所述苯丙素类衍生物化合物是茋类化合物或查耳酮化合物.10.根据权利要求9所述的宿主，其中所述茋是白藜芦醇或白藜芦醇衍生物.11.根据权利要求9所述的宿主，其中所述查耳酮是柚皮素或柚皮素衍生物.12.根据权利要求1至11中任一项所述的宿主，其中所述宿主包含微生物，所述微生物是酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞.13.根据权利要求12所述的宿主，其中所述细菌细胞包含埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞、乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞、乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞、棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞、醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞、不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞.14.根据权利要求13所述的宿主，其中所述酵母细胞是来自以下的细胞：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、光滑念珠菌(Candi...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃内斯托·西蒙贝西利亚，贝亚塔·乔安娜·列赫卡，卡洛斯·卡萨多·巴斯克斯，
申请(专利权)人：埃沃尔瓦公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH