本发明专利技术涉及一种利用诱变微生物发酵技术制备大黄酸的方法，所述诱变方法是以保藏编号：CGMCC No.12762的菌株为诱导对象，以大黄酚为诱导药物，以小剂量浓度递增法进行诱导，得到的耐大黄酚菌株Penicillium sp.R‑02为在大黄酚浓度为4mg/mL时仍可稳定生长并传代的菌株；耐大黄酚菌株Penicillium sp.R‑02可将浓度为大黄酚2‑3g/L的大黄酚转化为大黄酸。
A method of preparing Rhein by mutagenic microorganism fermentation technology
The invention relates to a method for preparing Rhein by mutagenic microbial fermentation technology. The mutagenic method is to take the strain CGMCC No.12762 as the induction object, to take chrysophanol as the induction drug, and to induce the strain Penicillium sp.R_02 to be chrysophanol by the method of increasing the concentration of small doses. The strain could still grow steadily at 4 mg/mL, and the chrysophanol-tolerant strain Penicillium sp.R.02 could convert chrysophanol at 2.3 g/L to rhein.
【技术实现步骤摘要】
一种利用诱变微生物发酵技术制备大黄酸的方法
本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用诱变微生物发酵技术制备大黄酸的方法。
技术介绍
大黄酸是中药芦荟、大黄等的主要有效成分，属单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，含有2个羟基和1个羧基，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降糖调脂、保肝抗纤维化等多方面具有活性。本专利技术提供一种利用诱变微生物发酵技术将大黄酚转化为大黄酸的制备工艺。
技术实现思路
本专利技术提供一种大黄酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入发酵培养基中，于26～28℃静置培养8-12天，得发酵物；(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调pH至3-5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调pH至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸。步骤(1)中，耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02为在大黄酚浓度为4mg/mL时仍可稳定生长并传代的菌株；该菌株是以大黄酚为诱导药物，以保藏编号：CGMCCNo.12762的海洋真菌青霉Penicilliumsp.HK1-6为诱导对象，制备得到的；每升种子培养基的配方如下：葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、粗海盐2.5g/L、碳酸钠5g/L，余量为水；步骤(2)中每升发酵培养基的配方如下：葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、粗海盐2.5g/L、碳酸钠5g/L、大黄酚2-3g，余量为水。本专利技术的另一实施方案提供上述耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02的制备方法，以保藏编号：CGMCCNo.12762的海洋真菌青霉Penicilliumsp.HK1-6为诱导对象，以大黄酚为诱导药物，以小剂量浓度递增法制备；其特征在于包括如下步骤：在培养基中加入1.0μg/mL的大黄酚，接种保藏编号：CGMCCNo.12762的菌株，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄酚浓度为10μg/mL的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄酚浓度为20μg/mL的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，重复上述操作，所用培养基中的大黄酚浓度依次增加至50、100、200、500、1000、2000、3000、4000μg/mL，直至筛选出可以在4mg/mL浓度下，可正常生长并稳定传代的菌株，即为耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02。本专利技术的另一实施方案提供上述耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02在制备大黄酸中的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：通过使用大黄酚对真菌CGMCCNo.12762进行诱导，得到耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02，该菌株可以将大黄酚转化为大黄酸，转化操作简便且转化率高。具体实施方式为了便于对本专利技术的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解专利技术而并非用来限定本专利技术的范围或实施原则，本专利技术的实施方式不限于以下内容。实施例1以保藏编号：CGMCCNo.12762的海洋真菌青霉Penicilliumsp.HK1-6为诱导对象，以大黄酚为诱导药物，以小剂量浓度递增法制备耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02。在培养基中加入1.0μg/mL的大黄酚，接种保藏编号：CGMCCNo.12762的菌株，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄酚浓度为10μg/mL的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄酚浓度为20μg/mL的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，重复上述操作，所用培养基中的大黄酚浓度依次增加至50、100、200、500、1000、2000、3000、4000μg/mL，直至筛选出可以在4mg/mL浓度下，可正常生长并稳定传代的菌株，即为耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02；每升培养基的配方为：葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、蛋白胨2g/L、粗海盐2.5g/L、碳酸钠5g/L、余量为水。实施例2(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0L，平均分装于10个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。将耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄酚100g、水50L，平均分装于100个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养8天，得发酵物；(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调pH至3-5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调pH至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸(104.33g，转化率达93.3％，HPLC纯度97.9％，1HNMR和MS数据与已知报道一致)。实施例3(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0L，平均分装于10个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。将耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄酚150g、水50L，平均分装于100个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养12天，得发酵物；(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调pH至3-5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调pH至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸(142.52g，转化率达85.0％，HPLC纯度98.8％，1HNMR和MS数据与已知报道一致)。实施例4(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0L，平均分装于10个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。将未经大黄酚诱导的菌(保藏编号：CGMCCNo.12762的海洋真菌青霉Penicilliumsp.HK1-6)接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄酚100g、水50L，平均分装于100个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养，2天后发现该本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大黄酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将耐大黄酚菌株Penicillium sp.R‑02接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入发酵培养基中，于26～28℃静置培养8‑12天，得发酵物；(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调pH至3‑5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5‑10min后，过滤收集滤液，调pH至3‑5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸。
【技术特征摘要】
1.一种大黄酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；(2)取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入发酵培养基中，于26～28℃静置培养8-12天，得发酵物；(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调pH至3-5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调pH至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸。2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中，耐大黄酚菌株Penicilliumsp.R-02为在大黄酚浓度为4mg/mL时仍可稳定生长并传代的菌株；该菌株是以...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈秀清，
申请(专利权)人：扬州工业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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