靶向CD19的嵌合抗原受体及联合表达抗PD1抗体可变区的方法和及其用途技术

本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体CD19 scFV‑CD8hinge‑CD28TM‑CD28‑CD3ζ联合aPD1 scFV CAR‑T细胞及其用途。具体而言，本发明专利技术提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗CD19单链抗体的编码序列、人CD8α铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人CD28胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、以及P2A多肽编码序列、人IL2信号肽编码序列、抗人PD1单克隆抗体编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明专利技术还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明专利技术制备的CD19‑28z‑aPD1 CAR‑T细胞对特异性肿瘤细胞都具强烈的杀伤功能。本发明专利技术制备的CD19‑28z‑aPD1 CAR‑T细胞带有分泌PD1抗体功能，可封闭PD1‑PDL1位点，使CAR‑T细胞免受PD1的抑制作用。

Chimeric antigen receptors targeting CD19 and methods for co-expression of variable regions of anti-PD1 antibodies and their applications

The invention discloses a chimeric antigen receptor CD19 scFV CD8 hinge CD28TM CD28 CD3 combined with aPD1 scFV CAR T cells and its use. Specifically, the present invention provides a polynucleotide sequence selected from: (1) the coding sequence containing sequentially linked anti-CD19 single chain antibodies, the coding sequence of human CD8alpha hinge region, the coding sequence of human CD28 transmembrane region, the coding sequence of human CD28 intracellular region, the coding sequence of human CD3 intracellular region, and the coding sequence of P2A polypeptide, and human I. L2 signal peptide coding sequence, anti-human PD1 monoclonal antibody coding sequence, and (2) (1) the complementary sequence of the polynucleotide sequence. The invention also provides the relevant fusion protein, the carrier containing the coding sequence, and the use of the fusion protein, the coding sequence and the carrier. The CD19 28z aPD1 CAR T cells prepared by the invention have strong killing function to specific tumor cells. The CD19 28z aPD1 CAR T cells prepared by the invention have the function of secreting PD1 antibody, and can block the PD1 PDL1 locus, so that the CAR T cells are not inhibited by PD1.

【技术实现步骤摘要】
靶向CD19的嵌合抗原受体及联合表达抗PD1抗体可变区的方法和及其用途
本专利技术属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向CD19CAR联合表达抗PD1抗体可变区细胞及其用途。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区、以及P2A多肽、人IL2信号肽、和抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区的融合蛋白；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；优选地，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体FMC63。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：(1)含有依次连接的CD8抗原的前导肽、抗CD19单链抗体、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区、人CD28胞内区和人CD3ζ胞内区、以及P2A多肽、人IL2信号肽、和抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区的融合蛋白；和(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；优选地，所述抗CD19单链抗体为抗CD19单克隆抗体FMC63。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：所述CD8抗原前导肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2第1-21位氨基酸所示；所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第22-128位氨基酸所示；所述抗CD19单链抗体的重链可变区的氨基酸序列可如SEQIDNO:2第144-263位氨基酸所示；所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第264-310位氨基酸所示；所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第311-337位氨基酸所示；所述人CD28胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第338-378位氨基酸所示；所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第379-489位氨基酸所示；所述人P2A的氨基酸序列如SEQIDNO:2第490-515位氨基酸所示；所述人IL2信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2第516-535位氨基酸所示；所述抗PD1单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第536-648位氨基酸所示；所述抗PD1单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:2第664-770位氨基酸所示。3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，在所述抗CD19单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQIDNO:1第1-63位核苷酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第64-384位核苷酸序列所示；和/或所述抗CD19单链抗体的重链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第430-789位核苷酸序列所示；和/或所述人CD8α铰链区的编码序列如SEQIDNO:1第790-930位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28跨膜区的编码序列如SEQIDNO:1第931-1010位核苷酸序列所示；和/或所述人CD28胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第1011-1134位核苷酸序列所示；和/或所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQIDNO:1第1135-1467位核苷酸序列所示；所述人P2A的编码序列如SEQIDNO:1第1368-1545位核苷酸序列所示；所述人IL2信号肽的编码序列如SEQIDNO:1第1546-1605位核苷酸序列所示；所述抗PD1单链抗体的重链链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第1606-1944位核苷酸序列所示；所述抗PD1单链抗体的轻链可变区的编码序列如SEQIDNO:1第1990-2310位核苷酸序列所示。4.如权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飞，金涛，王海鹰，何凤，史子啸，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31