调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法技术方案

本发明专利技术涉及一种调节CHO‑K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，将CHO‑K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，在细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使CHO‑k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。这种方法在细胞培养工艺流程即能够根据需要，调节酪氨酸或半胱氨酸的添加量即可提高或降低抗体酸性峰含量，且调节剂不影响细胞的生长，抗体表达量高。

【技术实现步骤摘要】
调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法
本专利技术涉及细胞培养方法领域，特别是涉及一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法。
技术介绍
单克隆抗体具有高特异性、低副作用、效果优异的特点，在治疗和诊断中应用越来越广泛。其中，CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞，ChineseHamsterOvery)是生产单克隆抗体蛋白药物应用最为广泛的宿主细胞，有近70％已经上市的治疗性蛋白是由CHO细胞表达生产的。相对于其他细胞表达系统，CHO细胞具有与人相似的翻译后修饰、历史背景清晰、细胞稳健、生长迅速等优势。然而由于单克隆抗体具有复杂的大分子结构，在生产和储存过程中会产生大量修饰。比如糖基化、氧化、脱酰胺等，使得抗体产生大量的异质性，也被称为电荷异构体。采用CEX-HPLC或CIEF方法进行分析会得到一系列的峰，主要分为三类酸性峰、主峰、碱性峰。电荷异构体对单抗稳定性及生物学功能的发挥具有重要的影响，因而其成为单抗生产工艺中需要控制的非常重要的质量属性，也是生产工艺稳定性的重要反应指标。电荷异构体产生酸碱峰，碱性峰主要来源于C末端赖氨酸去除不完全、N末端焦谷氨酰胺环化胺等。酸性峰一般来源于N-糖末的唾液酸化修饰、氨基酸残基的脱酰胺等。但此酸性峰和碱性峰对应的电荷异构体具有相似的化学性质，通过后期纯化分离控制电荷异质性具有一定的难度，而通过控制细胞培养工艺流程来控制抗体电荷异质性的方法也具有一定的挑战性，成为本领域一直难于解决的问题。一种方法是在培养基中添加谷氨酰胺降低酸性峰的含量，然而谷氨酰胺对后期的工艺的稳定性带来非常不利的影响，在培养过程中加入谷氨酰胺后，谷氨酰胺易降解，产生大量NH4+，对细胞生长表达带来不利的影响。此外，对于CHO表达系统，加入谷氨酰胺仅能降低所分泌抗体的酸性峰的含量，无法根据需要提高抗体酸性峰的含量。对于一些抗体类的生物类似药，常存在与原药相比酸性峰含量降低的情况，但在临床使用中，出于安全性的考虑，保持类似药和原药相似的酸性峰是非常有必要的，因此如何提高抗体酸性峰含量是一个非常棘手的问题。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种能够根据需要调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量并能够提高抗体表达量的方法。一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，及在所述细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使所述CHO-k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，所述调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。在一个实施方式中，其中所述培养基为：CDoptiCHOTMAGTTM培养基、CellventoTMCD-220培养基、Dynamis培养基或Advance培养基中的一种或多种的混合。在一个实施方式中，还包括在所述细胞培养过程中添加补料培养基，所述补料培养基为：EffendentFeedTMA+、EffendentFeedTMB+或Cellboost7a补料培养基中的一种或多种的混合。在一个实施方式中，所述补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。在一个实施方式中，所述在所述细胞培养过程中添加调节剂的操作具体为：在所述细胞培养过程中添加酪氨酸，所述酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，在所述细胞培养过程中添加半胱氨酸，所述半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，在所述细胞培养过程中添加酪氨酸和半胱氨酸，所述酪氨酸和所述半胱氨酸总的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。在一个实施方式中，在所述细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L。在一个实施方式中，所述CHO-K1细胞为携带GS基因且在所述GS基因的下游插入了外源性基因表达载体的细胞。在一个实施方式中，所述外源性基因表达载体选自纳武单抗表达载体、贝伐珠单抗表达载体和阿达木单抗表达载体中的至少一种。一种降低CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，所述培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，所述Dynamis培养基与所述Advance培养基的体积比为1～2:1～2；及在所述培养基中培养1天～3天后，在所述培养基中添加酪氨酸和Cellboost7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使所述CHO-k1细胞分泌的所述目的抗体的酸性峰含量降低，其中，所述酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，所述Cellboost7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述Cellboost7a补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。一种提高CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，所述培养基中含有Dynamis培养基和Advance培养基，所述Dynamis培养基与所述Advance培养基的体积比为1～2:1～2；及在所述培养基中培养1天～3天后，在所述培养基中添加半胱氨酸和Cellboost7a补料培养基，并维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L，继续培养10天～15天以使所述CHO-k1细胞分泌的所述目的抗体的酸性峰含量提高，其中，所述半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)，所述Cellboost7a补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述Cellboost7a补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。在之前很长的一段时间内，细胞培养研究的目的主要是为了提高目的蛋白的表达量。随着表达量越来越高，最近研究者开始关注细胞培养对抗体质量的影响。但细胞培养较为复杂，研究起来难度较大，特别是细胞培养基，其营养成分非常复杂，目前的研究没有彻底摸索清楚培养基成分对抗体质量的影响。细胞培养的氨基酸种类较多，研究较多的是谷氨酰胺，因为它作为细胞培养常用的氮源，对其他氨基酸的作用研究的很少。但目前稳定CHO细胞株筛选系统为谷氨酰胺合成酶系统(GS)，细胞培养时已不需要添加谷氨酰胺，因此目前常见的做法是不再调节额外的氨基酸作为调节剂。本专利技术在调节剂的选择等方面进行了大量的探索研究，打破之前的技术偏见，预料不到地发现，将CHO-K1细胞接种到培养基中培养，并在细胞培养过程中添加酪氨酸或半胱氨酸能够调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量。这种方法在细胞培养工艺流程即能够根据需要，调节酪氨酸或半胱氨酸的添加量即可提高或降低抗体酸性峰含量，且调节剂不影响细胞的生长，抗体表达量高。附图说明图1为实施例1～实施例15的各组细胞分泌的抗体表达量结果统计图；图2为实施例1～实施例5的各组活细胞密度结果统计图；图3为实施例6～实施例10的各组活细胞密度结果统计图；图4为实施例11～实施例15的各组活细胞密度结果统计图；图5为实施例11～实施例15的各组细胞分泌的抗体酸性峰含量结果统计图；图6为抗体酸性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种调节CHO‑K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将CHO‑K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，及在所述细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使所述CHO‑k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，所述调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.一种调节CHO-K1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：将CHO-K1细胞接种到培养基中进行细胞培养，及在所述细胞培养过程中添加调节剂，继续培养以使所述CHO-k1细胞分泌具有合适酸性峰含量的目的抗体，其中，所述调节剂选自酪氨酸和半胱氨酸中的至少一种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述培养基为：CDoptiCHOTMAGTTM培养基、CellventoTMCD-220培养基、Dynamis培养基或Advance培养基中的一种或多种的混合。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在所述细胞培养过程中添加补料培养基，所述补料培养基为：EffendentFeedTMA+、EffendentFeedTMB+或Cellboost7a补料培养基中的一种或多种的混合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述补料培养基的加入方式为1天/次～3天/次，每次加入的所述补料培养基占所述培养基总体积的1％～5％。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在所述细胞培养过程中添加调节剂的操作具体为：在所述细胞培养过程中添加酪氨酸，所述酪氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，在所述细胞培养过程中添加半胱氨酸，所述半胱氨酸的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)；或者，在所述细胞培养过程中添加酪氨酸和半胱氨酸，所述酪氨酸和所述半胱氨酸总的添加量为0.01mmol/(L·天)～1.2mmol/(L·天)。6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/L～6g/L。7.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述CHO-K1细胞为携带GS基因且在所述GS基因的下游插入了外源性基因表达载体的细胞。8....

【专利技术属性】
技术研发人员：肖尚，翁源灿，
申请(专利权)人：深圳市菲鹏生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44