一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法技术

本发明专利技术公开了一种吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，包括如下步骤：(1)多粘类芽孢的芽孢化培养；(2)5‑氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择；(3)氨基酸协同5‑氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择；(4)亚硝基胍(NTG)对多粘类芽孢杆菌的诱变；(5)甘氨酸联合5‑氟色氨酸培养平板定向筛选培养；(6)多粘类芽孢杆菌突变株产吲哚乙酸能力分析。本发明专利技术采用NTG诱变联合定向筛选平板培养方案具有选育高效、定向性强、周期短等优势，后代有81％的突变菌株高产吲哚乙酸，达到1mg/mL；其中最高产突变菌株达到2.24mg/mL,是原始野生菌株的28倍。

【技术实现步骤摘要】
一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法
本专利技术属于生物工程及生物有机肥用领域，涉及一种产吲哚乙酸的定向育种方法。具体地讲，本专利技术涉及一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法。
技术介绍
植物促生菌是一类广泛存在于植物土壤、根际、叶际范围，能够促进植物生长或拮抗病原菌的有益细菌。植物促生菌可研发成多种微生物菌肥或微生物农药，发挥其促生和防治功能。多粘类芽孢杆菌是类芽孢杆菌属中的一种革兰氏阳性菌，可以产生多种抗菌物质及生理活性物质，被认为是一种很有效的植物生长促进根际微生物。多粘类芽孢杆菌作为植物促生菌，具有微生物农药和微生物菌肥的双重作用。多粘类芽孢杆菌的生防促生活性包括固氮、诱导植物的有关基因的表达、溶解土壤中的磷、产生多种抗菌物质及生理活性物质，如多粘菌素、细胞分裂素、植物生长素(吲哚乙酸，indole-3-aceticacid，IAA)等。IAA是天然植物生长素的主要活性成分，可增加植物根的大小和分布，有利于植物根从土壤中吸收更多的营养物质。多粘类芽孢杆菌可以通过分泌IAA促进宿主植物生长。例如，在未额外添加L-色氨酸的条件下，多粘类芽孢杆菌PaenibacilluspolymyxaRC05的IAA产量为6.8μg/mL；在额外添加25μg/mL的L-色氨酸的条件下，P.polymyxaRC05能产生32.8μg/mL的IAA。自然状态下筛选得到的多粘类芽孢杆菌产IAA的能力相对较弱，使多粘类芽孢杆菌产IAA特性的应用受到限制。对具有分泌IAA能力的多粘类芽孢杆菌进行诱变育种，提高IAA的产率，将更利于多粘类芽孢杆菌在农业生产中的应用。目前对野生型菌株进行诱导育种来提高IAA产量的方法主要有：1.诱变剂诱变育种。对解淀粉芽孢杆菌SC008进行紫外线和硫酸二乙酯复合诱变处理后，测定突变体发酵液中IAA含量，选出IAA产量最高的解淀粉芽孢杆菌SC008突变体，其IAA产量提高了1.63倍；2.微波诱变育种。对红豆草根瘤菌RS-1进行微波诱变处理后，测定突变体发酵液中IAA含量，选出IAA产量最高的突变体，其IAA产量提高了1.67倍。此外，通过转基因方法构建重组细胞也可有效提高菌株的IAA产量。重组解淀粉芽孢杆菌SQR9-E的IAA产量提高了4.2倍；重组枯草芽孢杆菌168-E的IAA产量提高了10倍。现有技术的缺陷在于：采用诱变剂对菌种诱变产生的突变库很难在培养平板上定向选育，由于缺乏对吲哚乙酸的特异性显色剂，所以只有通过对突变库的突变体进行培养后配合液相检测分析，这种筛选效率只有万分之一到十万分之一的概率获得优秀菌株。此外，吲哚乙酸作为多粘类芽孢杆菌的次生代谢物，目前的研究文献表明吲哚乙酸在细菌上生物合成的主要前体物质为色氨酸，不同的微生物基于色氨酸合成吲哚乙酸的途径有5类，涉及几十种关键的酶，所以很难通过分子手段直接改造某个基因进行定向育种。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，以解决现有多粘类芽孢杆菌高产吲哚乙酸中存在的关键技术问题，为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是：一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，包括以下主要步骤：①、多粘类芽孢的芽孢化培养将野生多粘类芽孢杆菌(CICC10580)接种至100mL的培养基A中，于30℃、220rpm/min条件下培养40～48h后显微镜镜检，待其完全芽孢化；培养基A组成为：蔗糖10g/L，豆粕粉20g/L，pH＝7.4；②、5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基B中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基B中分别添加不同浓度的5-氟色氨酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率为50％的添加浓度；培养基B组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；③、氨基酸协同5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基C中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基C中分别添加1mg/mL的19种氨基酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率达到95％的氨基酸添加组；培养基C组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5-氟色氨酸3g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；④、亚硝基胍(NTG)对多粘类芽孢杆菌的诱变离心收集步骤①中的芽孢，用0.1mol/L、pH＝6.8的PBS洗涤芽孢3次，并用0.1mol/L、pH＝6.8的PBS重新悬浮芽孢达1×108cuf/mL，添加终浓度为45ug/mL的NTG，30℃、160rpm/min的条件下处理30min(致死率为50％)；⑤、甘氨酸联合5-氟色氨酸培养平板定向筛选培养离心收集步骤④中的芽孢，用PBS洗涤芽孢3次终止诱变，并用PBS重新悬浮芽孢，将悬浮液涂布至定向培养平板培养基D，放置30℃恒温培养48h；培养基D组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5-氟色氨酸3g/L，甘氨酸1g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；⑥、多粘类芽孢杆菌突变株产吲哚乙酸能力分析从步骤⑤获得的平板上随机挑起100个多粘类芽孢杆菌突变株，并对该100个多粘类芽孢杆菌突变株进行产吲哚乙酸(IAA)能力分析；将多粘类芽孢杆菌突变株分别接种至5mL液体培养基E中，30℃、260rpm/min摇床培养24h，对培养液中吲哚乙酸做液相检测定量分析，对其中的最高产吲哚乙酸菌株进行保种；培养基E组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5-氟色氨酸0.2g/L，pH＝7.4。本专利技术的选育方法高效、定向性强、周期短等优势，后代有81％的突变菌株高产吲哚乙酸，达到1mg/mL；其中突变菌株11025A达到2.24mg/mL，是原始野生菌株的28倍。与现有技术相比，本专利技术的优点在于能快速准确的从突变的芽孢库中分离出高产吲哚乙酸的后代；(1)采用氨基酸联合5-氟色氨酸作为筛选平板，能有效的将NTG诱变库中高产吲哚乙酸的突变菌株选择性的培养；5-氟色氨酸作为色氨酸的结构类似物，能和色氨酸竞争性合成蛋白质，色氨酸合成能力强的菌株具备克服5-氟色氨酸的抑制作用，由于氨基酸的加入可以提高细胞的通透性，进一步提高了5-氟色氨酸的筛选压力，为有效筛选出吲哚乙酸高产菌株提供了准确性，大大减少了从突变后代中筛选的盲目性，明显减少筛选周期和工作量；(2)以多粘类芽孢杆菌的芽孢作为诱变对象，相对于以营养体为诱变对象具有诱变过程更加可控、重复性好、后代不需要进一步的纯化等优点；由于营养体细胞有些处于细胞增殖过程中，含有多个基因组，而芽孢只含有一个基因组，诱变后含有多个基因组的营养体细胞的性状不稳定。附图说明图1是本专利技术一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法技术流程图；图2是本专利技术实施例方法一中突变株产吲哚乙酸能力分析图；图3是本专利技术实施例方法二中突变株产吲哚乙酸能力分析图；图4是本专利技术实施例方法三中突变株产吲哚乙酸能力分析图；图5是本专利技术实施例方法四中突变株产吲哚乙酸能力分析图；具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。通过下列实施例将更具体的说明本专利技术，但是应理解所述实施例仅是为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，包括以下步骤：①、多粘类芽孢的芽孢化培养将野生多粘类芽孢杆菌接种至100mL的培养基A中，于30℃、220rpm/min条件下培养40～48h后显微镜镜检，待其完全芽孢化；培养基A组成为：蔗糖10g/L，豆粕粉20g/L，pH＝7.4；②、5‑氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基B中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基B中分别添加不同浓度的5‑氟色氨酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率为50％的添加浓度；培养基B组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；③、氨基酸协同5‑氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基C中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基C中分别添加1mg/mL的19种氨基酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率达到95％的氨基酸添加组；培养基C组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5‑氟色氨酸3g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；④、亚硝基胍(NTG)对多粘类芽孢杆菌的诱变离心收集步骤①中的芽孢，用0.1mol/L、pH＝6.8的PBS洗涤芽孢3次，并用0.1mol/L、pH＝6.8的PBS重新悬浮芽孢达1×108cuf/mL，添加终浓度为45ug/mL的NTG，30℃、160rpm/min的条件下处理30min；⑤、甘氨酸联合5‑氟色氨酸培养平板定向筛选培养离心收集步骤④中的芽孢，用PBS洗涤芽孢3次终止诱变，并用PBS重新悬浮芽孢，将悬浮液涂布至定向培养平板培养基D，放置30℃恒温培养48h；培养基D组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5‑氟色氨酸3g/L，甘氨酸1g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；⑥、多粘类芽孢杆菌突变株产吲哚乙酸能力分析从步骤⑤获得的平板上随机挑起100个多粘类芽孢杆菌突变株，并对该100个多粘类芽孢杆菌突变株进行产吲哚乙酸能力分析；将多粘类芽孢杆菌突变株分别接种至5mL液体培养基E中，30℃、260rpm/min摇床培养24h，对培养液中吲哚乙酸做液相检测定量分析，对其中的最高产吲哚乙酸菌株进行保种；培养基E组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5‑氟色氨酸0.2g/L，pH＝7.4。...

【技术特征摘要】
1.一种高产吲哚乙酸的多粘类芽孢杆菌快速定向选育方法，包括以下步骤：①、多粘类芽孢的芽孢化培养将野生多粘类芽孢杆菌接种至100mL的培养基A中，于30℃、220rpm/min条件下培养40～48h后显微镜镜检，待其完全芽孢化；培养基A组成为：蔗糖10g/L，豆粕粉20g/L，pH＝7.4；②、5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基B中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基B中分别添加不同浓度的5-氟色氨酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率为50％的添加浓度；培养基B组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；③、氨基酸协同5-氟色氨酸对多粘类芽孢杆菌生物阻断压力选择取步骤①中的芽孢接种至培养基C中，每个平板接种100个芽孢，所述培养基C中分别添加1mg/mL的19种氨基酸，30℃恒温培养48h，从中找到致死率达到95％的氨基酸添加组；培养基C组成为：蔗糖10g/L，酵母粉20g/L，5-氟色氨酸3g/L，琼脂粉15g/L，pH＝7.4；④、亚硝基胍(NTG)对多粘类芽孢杆菌的诱变离心收...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁林，郭建军，曾静，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，江西绿悦生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36