用于增强群体中的遗传和表观遗传变异性的转座因子移动制造技术

本发明专利技术提供了一种使转座因子移动的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供DNA甲基化抑制剂和/或转录抑制剂，和b)使所述抑制剂与包含失活的转座因子的细胞接触，从而产生具有移动的转座因子的细胞。在本发明专利技术的第二方面，提供了一种增加多个真核细胞生物体中的遗传变异和/或表观遗传变异性的方法。所述方法包括以下步骤：i.提供DNA甲基化抑制剂和/或转录抑制剂，ii.使所述生物体与所述抑制剂接触，和iii.使所述生物体繁殖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强群体中的遗传和表观遗传变异性的转座因子移动
本专利技术涉及转座因子的移动(mobilisation)及其相关用途。
技术介绍
转座因子(transposableelements,TE)最初因其能够影响玉米中的核色素沉着(杂色化)的诱变活性而在二十世纪五十年代早期被BarbaraMcClintock发现(McClintock,PNAS,195036(6):344-55)。自其最初被发现以来，许多功能已归因于TE。事实上，现在趋向于将TE视为能够重塑基因组的天然分子工具(Bire等，MethodsMolBiol,2012；859:1-28)。TE已被鉴定为在构建宿主基因组方面起到重要作用(如果不是主要作用)；尤其是着丝粒区富含TE。已发现长末端重复序列(LTR)逆转录转座子的拷贝数与宿主基因组的大小紧密相关，并且TE的移动能够通过诱导染色体断裂和通过影响同源重组来对基因组组织结构产生影响。在基因水平，TE可以具有多重效果：通过直接插入基因而导致突变、在基因组内移动基因、复制和/或创建新基因、调控基因表达、创建新的调控途径以及使基因受到表观遗传控制。目前，TE被认为是能够突出对宿主的诱变的正面结果的诱变剂(Bennetzen等，AnnuRevPlantBiol,2014,65:505-30)。TE已经证实是非常有用的遗传工具，并且已被广泛用来在多种多样的生物体中进行基因阻断和诱变。然而，由于TE在正常生长条件下天然地极少被激活，因而目前仅少数活性TE是已知的。因此，仅有极为有限的几种TE被积极用于遗传修饰。一些实例包括P因子(果蝇)、PiggyBac(昆虫、人细胞系)、L1LINE因子(小鼠)、Mariner(脊椎动物)、SleepingBeauty(动物)。为了建立遗传多样性，这些TE通过转基因被引入所关注的生物体内。然而，这限制了以这种方式修饰的生物体的应用，因为这在目前的法规下被视为是转基因生物(GMO)。在植物中，已表明转座因子的移动性受DNA甲基化和某些组蛋白标记物的限制(Miura等，Nature,2001,411(6834):212-4；Mirouze等，Nature,2009,461(7262):427-30)。遗传突变体中的DNA甲基化的抑制因此能导致转座因子的移动。此外还显示，减少DNA甲基化的药物(例如5-氮杂-2'-脱氧胞苷)能够使某些DNATE移动(Scortecci等，PlantCellPhysiol,1997,38(3):336-43)。此外，据报道，在RNA引导的DNA甲基化(RdDM)方面有缺陷的植物所受到的应激激活了转座因子(Ito,H.等，Nature,2011,472:115–19)。然而，对遗传突变体在参与抵御TE的成分方面的要求限制了在非模型生物体或难以转化的生物体中活化TE的可能性。因此，利用内源性TE来获得遗传和表观遗传多样性目前非常受限。在正常生长条件下，TE极少移动，而用于激活TE的不同处理方法迄今为止在真核细胞中效率一直极低。采用减少基因组DNA甲基化水平的药物的处理方法已显示可允许TE的中等活化(Baubec,T.等，PlantJ,200957:542–54)，但不会导致那些TE的新插入。在植物中已显示，参与RNA引导的DNA甲基化途径的因子的突变能够使TE以高频率移动。这些方法中的重要限制在于，其或者效率低(上述药物处理)，或者需要难以获得的遗传突变(尤其是在非模型生物体中)。因此，这些技术问题限制了转座因子在大多数生物体中的应用和研究。本专利技术所探讨的问题是提供高效移动转座因子的手段。该问题由独立权利要求的主题解决。
技术实现思路
专利技术人在本文提供了一种能够使真核细胞中的转座因子移动的基于药物的处理。另外，该处理与特定应激的组合导致了响应于该特定应激的特定TE的移动。所述处理导致活化的TE染色体外DNA在被处理的生物体中高度积聚。此外，被处理的生物体的后代显示出大量TE拷贝在基因组中的稳定整合以及对应激(其为该处理一部分)的抗性增加。因此，本专利技术的方法克服了导致TE防御失活的遗传突变的必要性，由此允许转座因子在几乎任何真核细胞中被高效活化。本专利技术使得能够诱导TE介导的在基因组大小和结构方面的改变，调节内源性基因表达、基因转复制(transduplication)、杂种优势、同源重组和应激适应。此外，本专利技术允许鉴定新型功能性TE。根据本专利技术的第一方面，提供了一种使真核细胞、特别是基因组内的转座因子移动的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供包含一个或多个休眠的(即，失活的)转录因子的真核细胞，和b)使所述细胞与转录抑制剂接触，并且可选地使所述细胞另外与DNA甲基化抑制剂接触，由此产生具有一个或多个移动的转座因子的真核细胞。在本说明书的上下文中，术语“转座因子”或“转座子”以其在分子遗传学领域中已知的含义使用；其是指生物体基因组中的DNA序列，其能够改变其在基因组内的位置(剪切粘贴机制)或者能够产生整合至基因组内的自身的新拷贝(复制粘贴机制)。转座能够导致因子的倍增，从而影响基因组的大小。存在两类转座子，1类转座子也称为逆转录转座子，2类转座子也称为DNA转座子。逆转录转座子首先被宿主细胞所提供的分子装置转录成RNA，然后被逆转录成该RNA的双链DNA拷贝(称为互补DNA(cDNA))，其后被插入至基因组内的新位置。它们与逆转录病毒共享某些特征，例如对逆转录酶的依赖性。DNA转座子没有RNA中间体，且被转座酶转移至其在基因组中的新位置。基因组中大多数转座子是失活的，不会复制或改变位置。因此，转座子的激活也称作转座子的移动(mobilization)。响应于某些应激的转座子的实例提供于表1中。这些转座子被所指示的应激激活至某种程度。然而，使用本专利技术的方法使这些转座子移动的程度比所提供的实例中所能看到的程度大得多。在本专利技术的任何方面的某些实施方式中，1类转座子被移动。在本专利技术的任何方面的某些实施方式中，2类转座子被移动。在本说明书的上下文中，术语“DNA甲基化”以其在分子生物学和分子遗传学领域中已知的含义使用；其是指向DNA添加甲基，这在真核细胞中主要发生在半胱氨酸上。DNA的甲基化由DNA甲基转移酶(DNMT)催化并且可以划分为维持甲基化(这对于将甲基化谱转移到新合成的DNA链上是必需的)和从新甲基化。DNA甲基化与基因表达的失活和转座子沉默相关。DNA甲基化可以被传至后续世代中，因此代表着表观遗传修饰的常见形式。表1.转座子的实例在某些实施方式中，DNA甲基化抑制剂是外源性化合物。在某些实施方式中，转录抑制剂是外源性化合物。在某些实施方式中，所述外源性化合物是分子量≤1000u、特别是≤920u的小分子化合物。在本说明书的上下文中，术语“外源性化合物”是指在生理条件下不存在于细胞中的分子(除非是技术性添加的)。在某些实施方式中，DNA甲基化抑制剂可以在至少一些特定生理条件下以痕量存在于至少一些细胞中，但在本专利技术的方法中以高得多的浓度添加DNA甲基化抑制剂以对细胞生理学产生显著影响。为实现这点，化合物以如下浓度存在于细胞培养基中：该浓度经选择为存在于细胞内部的DNA甲基化抑制剂的浓度的至少10倍。在某些实施方式中，转录抑制剂在生理条件下存在于细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使真核细胞中的转座因子移动的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含转座因子的真核细胞，b)使所述细胞与转录抑制剂接触，由此产生具有移动的转座因子的真核细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.02 EP 15197663.61.一种使真核细胞中的转座因子移动的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含转座因子的真核细胞，b)使所述细胞与转录抑制剂接触，由此产生具有移动的转座因子的真核细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤b)中使所述细胞另外与DNA甲基化抑制剂接触。3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA甲基化抑制剂和/或所述转录抑制剂是外源性化合物，特别是外源性小分子化合物。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其另外包括步骤c)：c)使所述细胞暴露于非生物应激、生物应激或化学应激。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述细胞分离并确定所述细胞的表型是否已改变的后续步骤。6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述真核细胞是多细胞生物体、特别是非人生物体、特别是植物的一部分，且其中在使所述细胞暴露于步骤c)后，培养所述细胞以生成多细胞生物体并确定所述多细胞生物体的表型、特别是对应激源的抗性，其中所述应激源导致了步骤c)中所施加的应激。7.如权利要求6所述的方法，其中，所述植物细胞是作物植物、特别是稻、甘蔗、玉米、小麦、裸麦、大麦、燕麦或粟的一部分。8.一种增加真核细胞生物体的群体中的遗传变异和/或表观遗传变异的方法，其包括：i.提供真核细胞生物体，ii.使所述真核细胞生物体接触-DNA甲基化抑制剂，和/或-转录抑制剂，iii.使所述真核细胞生物体繁殖，从而产生具有增加的遗传变异和/或表观遗传变异的真核细胞生物体的群体。9.如权利要求8所述的方法，其在步骤ii之后另外包括步骤ii.a：ii.a使所述真核细胞生物体暴露于非生物应激、生物应激或化学应激。10.如权利要求7或8所述的方法，其中所述方法包括后续步骤iv，其包括：a.确定所述生物体中的任何遗传变化，和/或b.确定所述生物体的表型的任何变化，特别是对步骤ii.a中所施加的应激源的增加的抗性，其中，所述遗传变化或表型变化在个别的真核细胞生物体成员中确定，或针对真核细胞生物体群体的代表性样品确定，或者针对所述群体的所有真核细胞生物体成员确定。11.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中i.所述非生物应激选自热、冷、干旱、淹没/水过量、风、紫外辐射、核辐射、盐度、重金属、土壤pH、组织培养物栽培以及磷、氮、光或CO2的缺乏，和/或ii.所述生物应激选自真菌、细菌、病毒、昆虫的负面影响、食草动物造成的损伤以及生物竞争，和/或iii.所述化学应激选自除草剂、...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·布赫，M·蒂姆，
申请(专利权)人：巴塞尔大学，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH