一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，通过抽取外周静脉血，分离并提取单个核细胞，并诱导其分化为早期内皮祖细胞，且培养过程中严格控制技术参数。本发明专利技术方法简单易行，安全性高，且早期内皮祖细胞的得率高(98.8％)，适合大规模的推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法
本专利技术涉及一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，属于生物

技术介绍
内皮祖细胞(EPCs)有两种亚型，分别为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞，其两种亚型在细胞来源、细胞形态、细胞表面标志、细胞增殖能力、分化能力和功能方面存在差异。其共同存在的问题是内皮祖细胞的来源比较困难，或者获取细胞的风险较大。目前比较常见的是培养晚期内皮祖细胞。虽然晚期内皮祖细胞在形成内皮细胞和修复损伤内皮的功能较好，但是由于其抗氧化能力和抗炎能力均弱于早期内皮祖细胞，在进行自体回输治疗血栓栓塞性疾病时，由于机体普遍存在脂质过氧化和炎症的情况下，会影响晚期内皮祖细胞在体内的存活时间及功能。早期EPCs可通过分泌各种细胞因子促进损伤的血管内皮和缺血组织的内皮修复和血管生长、增强晚期EPCs的成血管作用，从而参与血管的新生。因此，有必要研究一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，为早期内皮祖细胞的推广应用奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法。本专利技术采取的技术方案如下：一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤：S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞。优选的，步骤S1中，磷酸盐缓冲液和外周静脉血的体积比为1:1。优选的，步骤S2中，稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。优选的，步骤S4中，单个核细胞层与磷酸盐缓冲液的体积比为1：3。优选的，步骤S7中，调整后细胞密度为1×107个/mL。优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持氧浓度为3％，培养的第2～3天，保持氧浓度为10％，培养至第4天，保持与室内氧浓度相同。优选的，步骤S7中，在培养箱内培养的条件为：培养的24h内，保持二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，保持二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，保持与室内二氧化碳浓度相同。优选的，步骤S7中，在培养的第2～3天，加入黄芪提取物和山苦茶提取物。优选的，黄芪提取物的浓度为1.2μg/mL，山苦茶提取物的浓度为1.0μg/mL。优选的，黄芪提取物的活性成分为黄芪多糖，山苦茶提取物的活性成分为山苦茶多糖。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：A.离心参数是关键要素之一，离心速度过快、时间过长、温度控制不合理，容易损伤细胞，成活率降低，离心过慢、时间过短，则导致细胞之间相互混杂，细胞纯度降低。本专利技术限定了每一次的离心参数，能最大限度的提高细胞存活率和纯度。B.本专利技术还具体限定了细胞接种密度和换液时机，在该条件下，细胞贴壁和分化最为理想。C.培养过程中，内皮祖细胞易分化为成熟的内皮细胞，从而限制了其在临床上的应用。本专利技术研究发现，在细胞培养过程中，合理控制氧浓度、二氧化碳浓度以及加入一定量的黄芪提取物和山苦茶提取物，有利于单个核细胞分化为早期内皮祖细胞，有利于早期内皮祖细胞的增殖，且有效缓解早期内皮祖细胞分化为成熟的内皮细胞的现象。D.本专利技术通过抽取外周静脉血，分离并提取单个核细胞，并诱导其分化为早期内皮祖细胞。方法简单易行，比较安全，由于早期内皮祖细胞相对于晚期内皮祖细胞，具有更强的抗炎和抗氧化能力，本专利技术为自体回输早期内皮祖细胞治疗血栓栓塞性疾病奠定了基础。E.本专利技术早期内皮祖细胞，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色后，显示双阳性，确定为内皮祖细胞。流式细胞仪检测所有细胞均为CD45+，说明该细胞是血液来源，98.8％的细胞为CD31+和CD45+，证明其为早期内皮祖细胞，得率非常高，余1.1％为CD45+CD31-，说明其为正在向早期内皮祖细胞转化。附图说明图1为细胞形态图；图2为Dil-ac-LDL染色结果；图3为Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色结果；图4为流式细胞仪检测结果图，图中，右侧为FSC-SSC散点图；左侧为FL1-FSC散点图。具体实施方式下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。本专利技术实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本专利技术实施例所述磷酸盐缓冲液为PhosphateBufferedSaline(1X)。本专利技术实施例所述淋巴细胞分离液为Ficoll-PaqueTMPLUS(GEHealthcare)。本专利技术实施例所述改进的EBM完全培养基为：EBMTM-2Medium+EGMTM-2-MV-SingleQuots+5％FBS美国lonza公司。每500mL改进的EBM完全培养基配方：445.3mLEBMTM-2Medium+29.7mLEGMTM-2-MV-SingleQuots+25mLFBS(10091148),胎牛血清(FBS)的终浓度为10％。其中EGMTM-2-MV-SingleQuots的配方如表1所示。表1实施例一、一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，包括以下步骤：S1：采集健康志愿者50mL静脉血，将血液置于5mLEDTA试管。取磷酸盐缓冲液和静脉血，按照体积比1：1稀释并混匀。S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，注意不要混匀。稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。S3：以400～500g离心40～50分钟(18℃～20℃)。S4：用移液器吸掉最上层(黄色混合物)，即血浆部分，并用移液器把第二层(单个核细胞层)转移到离心管中，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液按体积比1:3混匀。S5：以400～500g离心10～20分钟(18℃～20℃)，倒掉上清液，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞。S6：400～500g离心10～20分钟(18℃～20℃)，去上清，即得单个核细胞。S7：将获得的单个核细胞用改进的EBM完全培养基重悬，调整细胞密度为1×107个/mL，放置于人纤维黏连蛋白(humanfibronectin，HFN)包被的T75细胞培养瓶，放入培养箱中。培养的24h内，保持氧浓度为3％，二氧化碳浓度为3.5％，培养的第2～3天，加入1.2μg/mL黄芪多糖和1.0μg/mL山苦茶多糖，保持氧浓度为10％，二氧化碳浓度为4.5％，培养至第4天，二氧化碳浓度和氧气浓度保持与室内相同。每3天用改进的EBM完全培养基进行换液一次。第3天在倒置显微镜下观察细胞形态，第4～5天进行早期内皮祖细胞的鉴定。实施例二、早期内皮祖细胞的鉴定2.1细胞形态学鉴定多数细胞是圆形，出现成簇现象，有部分细胞出现梭形，呈条索样分布(见本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将磷酸盐缓冲液和外周静脉血混匀，得到稀释的血液；S2：把稀释的血液加到淋巴细胞分离液上，不要混匀；S3：以400～500g离心40～50分钟，温度控制在18℃～20℃；S4：除去血浆部分，取出单个核细胞层，将单个核细胞层与磷酸盐缓冲液混匀；S5：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，并用15～20mL磷酸盐缓冲液重悬细胞；S6：以400～500g离心10～20分钟，温度控制在18℃～20℃，弃上清，即得单个核细胞；S7：将获得的单个核细胞用EBM完全培养基重悬，调整细胞密度后，放置于人纤维黏连蛋白包被的细胞培养瓶，放入培养箱中；培养至4～5天，即得早期内皮祖细胞。2.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S1中，磷酸盐缓冲液和外周静脉血的体积比为1:1。3.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S2中，稀释的血液与淋巴细胞分离液的体积比为4：3。4.根据权利要求1所述的人外周血源性早期内皮祖细胞的培养方法，其特征在于，步骤S4中，单个...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘月丽，刘辉，葛浩毅，安彦峰，
申请(专利权)人：海南医学院，
类型：发明
国别省市：海南,46