β3-endonexin蛋白因子可作为调控新生血管形成的靶标分子的应用制造技术

本发明专利技术涉及β3‑endonexin蛋白因子作为靶点分子在调控新生血管形成中的应用。下调β3‑endonexin在血管内皮细胞的表达或用可以与β3‑endonexin结合的小分子多肽化合物作用于血管内皮细胞时，可有效抑制血管内皮细胞内血管生成因子（VEGF）的表达，而且会降低血管内皮细胞的增殖以及血管内皮细胞形成血管样结构的能力。因此，该发明专利技术证实了血管内皮细胞表达的β3‑endonexin蛋白因子是一个开发抗血管新生药物的有效靶点，并基于该因子提供了两种有效的抗新生血管形成的方法。

【技术实现步骤摘要】
β3-endonexin蛋白因子可作为调控新生血管形成的靶标分子的应用
本专利技术属于生物医学领域，特别涉及一种血管内皮细胞中的β3-endonexin蛋白因子可作为调控新生血管形成的靶标分子的应用。
技术介绍
β3-endonexin是一种可与整合素β3亚基的胞内序列特异性结合的多肽蛋白因子，表达于血管内皮细胞、血小板等细胞中。目前发现β3-endonexin有四种剪接体：β3-endonexin-S(111个氨基端，12.6kDa)，β3-endonexin-L(170个氨基酸，19.2kDa)，NRIF3(核受体共激活物)，以及一种编码62个氨基酸的剪接体θ相关蛋白(TAP)20。血管内皮细胞中主要表达β3-endonexin-S。本文中的β3-endonexin指的是β3-endonexin-S。前期有研究证实，β3-endonexin可与整合素β3胞内序列相互作用，但并不与β1胞内序列相互作用。目前已发现β3-endonexin具有多种功能，比如，可调控血小板整合素GPIIbIIIa的亲和力；在血管内皮细胞中调控NF-κb依赖性的uPAR表达等。有一项研究发现β3-endonexin在化疗后的肺癌组织中表达上调，说明其与肿瘤的生长可能具有一定的调控关系。整合素是一类广泛分布于细胞表面的黏附分子受体,由α、β两个亚基组成,并以非共价键形式连接成异二聚体蛋白分子。整合素每个亚基包括胞外区、跨膜区及胞内区3个部分。整合素的不同α、β链的结合决定了其与不同胞外基质蛋白配体结合的特异性，目前已经发现有18种α亚基和8种β亚基,由它们组成的整合素有24种整合素的生物学功能主要包括介导细胞与细胞和细胞与胞外基质之间的相互作用细胞的信号转导与活化，细胞的伸展和迁移，细胞的生长和分化、炎症、创伤愈合等过程，还参与细胞增殖，调控基因表达、细胞周期、细胞凋亡等生物学过程，同时整合素与肿瘤的发生发展密切相关，其通过调节内皮细胞的分化、黏附、迁移及存活，参与新生血管的形成和血管网络的构建。整合素在组织和细胞中的分布十分广泛，血管内皮细胞中表达多种整合素。之前的研究发现整合素αvβ3在新生血管内皮细胞中表达明显增高，并且可以作为抑制肿瘤血管内皮细胞增殖的靶点，通过阻断αvβ3与配体的结合来发挥抗肿瘤机制。但这一机制的有效性一直以来仍有争议，比如，默克公司2013年发布的一项临床研究结果表明，原先备受期待的整合素αvβ3拮抗剂clengitides在治疗胶质母细胞瘤的第III期临床试验中失败。这说明以整合素－配基结合为靶点而设计药物的路线还有待进一步探讨和优化。整合素在细胞信号转导过程中起着重要的作用，尤其是整合素β亚基与胞内蛋白的结合在调控肿瘤新生血管的发生中发挥重要作用。因此，以整合素β亚基胞内序列以及其结合蛋白为靶点来开发抗肿瘤新生血管形成的小分子药物具有可行性。迄今，已经发现几十种与整合素胞内序列结合的蛋白分子，其中包括Src蛋白激酶家族、黏着斑激酶FAK，还有Grb2、Kindlin、Talin和β3-endonexin等信号接头蛋白分子等，这些蛋白分子参与调控整合素信号，调控新生血管的形成。先前有文献表明，整合素β3亚基胞内序列能够识别结合β3-endonexin，但整合素β1和β2胞内序列并不与其结合。在此基础上，我们利用酵母双杂交系统检测了β3-endonexin与来自不同整合素β胞内序列(β1CT、β2CT、β3CT、β5CT、β6CT和β7CT)的结合情况，并发现β3-endonexin只与β3CT、β5CT和β6CT相互作用(其中与β3CT和β5CT的作用较强，而与β6CT的作用较弱)，并不与其他的整合素胞内序列结合。β3-endonexin与β3CT的结合显示β3-endonexin有可能在整合素αvβ3调控血管内皮细胞新生血管形成中发挥作用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种β3-endonexin蛋白因子作为靶点分子在调控新生血管形成中的应用。本专利技术的目的之二在于提供一种下调β3-endonexin蛋白因子在制备抑制抗新生血管形成药物中的应用。本专利技术的目的一之三在于提供下调β3-endonexin蛋白因子在制备抑制HUVEC血管内皮生长因子VEGF的表达药物中的应用。本专利技术的目的之四在于提供下调β3-endonexin蛋白因子在制备抑制HUVEC的增殖药物中的应用。本专利技术设计了特异的小分子干扰RNA来下调人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中β3-endonexin的表达，发现下调HUVEC中内源β3-endonexin表达后并不影响整合素所介导的细胞粘附和迁移，但可以有效抑制HUVEC细胞形成血管样结构的特性。进一步检测发现，下调β3-endonexin表达可抑制HUVEC血管内皮生长因子VEGF的表达以及HUVEC的增殖。同时，本专利技术根据β3-endonexin与整合素β3CT的结合位点设计了源自β3CT的小分子穿膜多肽化合物(称为mβ3CTP，该多肽与β3-endonexin结合)；并且根据同源性设计了源自β1CT的小分子穿膜多肽(称为mβ1CTP，该多肽不与β3-endonexin结合)作为对照。当我们用这两种多肽化合物与HUVEC作用后，发现mβ3CTP具有明显的抗新生血管形成的效果，并且可抑制VEGF的表达和HUVEC的增殖；而mβ1CTP没有以上的抗新生血管形成的作用。这些研究结果揭示β3-endonexin是一个新型的参与调控新生血管形成的关键因子，下调其表达或用可与其结合的小分子化合物可有效抑制新生血管的形成。下调β3-endonexin在血管内皮细胞中的表达或与其特异结合的小分子多肽化合物可有效抑制血管内皮细胞形成血管样结构，同时降低血管内皮细胞的增殖和血管内皮细胞内生长因子的表达。附图说明图1为下调人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)内源性β3-endonexin的表达可有效抑制HUVEC体外形成血管样小管结构。(a)将靶向β3-endonexin的siRNA(si-β3-endo)与无靶向序列的对照siRNA(siControl)分别转染HUVEC，48h后，抽提细胞总RNA进行反转录，并利用qPCR检测HUVEC中β3-endonexinmRNA的表达水平。(b,c)同时，收集转染si-β3-endo与siControl处理后的HUVEC分别铺在预先铺有基质胶的细胞培养48孔板内，并于8h后在倒置显微镜下观察HUVEC细胞形成管道样结构的情况，并对形成管道样结构的数目进行统计。统计结果以均值±标准差(Mean±SD)表示，实验独立样本均值采用独立样本t检验，p﹤0.01(**)说明数据在统计学分析中有显著差异。图2：下调人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的内源β3-endonexin的表达对HUVEC的粘附和迁移能力没有明显的影响。(a)将靶向β3-endonexin的siRNA(si-β3-endo)与无靶向序列的对照siRNA(siControl)分别转染HUVEC。48h后，HUVEC在激活(VEGF,20ng/ml)或非激活条件下与预铺在平板上的β3-型整合素配体fibrinogen(20μg/ml)孵育(37℃，30分钟)。孵育后洗去未粘附的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种β3‑endonexin蛋白因子作为靶点分子在调控新生血管形成中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种β3-endonexin蛋白因子作为靶点分子在调控新生血管形成中的应用。2.一种下调β3-endonexin蛋白因子在制备抑制抗新生血管形成药物中的应用。3.下调β...

【专利技术属性】
技术研发人员：马衍青，锁昕凤，褚羽丹，徐舟，鲍云，曹钟元，许祯，高娟，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海,31