抗MICA抗体制造技术

本发明专利技术提供了能够结合人MICA多肽的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在治疗以表达MICA的细胞为特征的障碍，特别是癌症中具有增加的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗MICA抗体相关申请的引用本申请要求2016年3月15日提交的美国临时申请号62/308,443的权益，该临时申请通过引用以其全文(包括任何附图和序列表)结合在此。序列表的引用本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“MICA2PCT_ST25txt”的文件，创建于2017年3月13日，大小是44KB。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文结合在此。
本专利技术提供了能够结合MICA多肽的抗原结合蛋白。这些抗原结合蛋白在治疗以表达MICA的细胞为特征的障碍(特别是癌症)中具有增加的活性。
技术介绍
免疫受体NKG2D通常在人T细胞(例如，CD8+T细胞、γδT细胞)和NK细胞上表达。在预激活的CD8+细胞上，NKG2D经由DAP10缔合作用而起CD28和TCR信号转导的协同共刺激剂的作用，而在NK细胞中它起直接激活剂的作用。配体接合后，NKG2D因此经由配对的DAP10衔接蛋白直接传递激活或共刺激信号，从而促进癌症和传染病免疫。已经鉴定并表征了人NKG2D(hNKG2D)的各种配体，包括主要组织相容性复合物I类相关链A和链B多肽(MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)家族、和视黄酸早期转录物-1(RAET1)家族。MICA通常与由微生物感染诱导的上皮肿瘤相关，并且在某些自身免疫性疾病病变中异常表达。MICA的结构类似于MHCI类的蛋白质折叠，具有α1α2平台结构域和膜近端Ig样α3结构域(Li等人2001Nat.Immunol.[自然免疫学]2:443)。MICA及其近亲MICB(其也充当NKG2D的配体)都是多态性的，并且已经显示多态性影响对NKG2D的亲和力(Steinle等人2001Immunogenetics[免疫遗传学]53:279)。在缺乏MHCI类链(MIC)基因(结构上与ULBP相关的蛋白质家族)的小鼠中，视黄酸早期(RAE-1)分子作为NKG2D的配体起作用。已经显示RAE-1表达由致癌物诱导并且刺激T细胞的抗肿瘤活性。然而，鼠NKG2D识别人MICA多肽(Wiemann(2005)J.Immunol.[免疫学杂志]175:820-829)。通过MICA以可溶形式从肿瘤细胞的细胞表面(例如，*019等位基因)和外泌体表面(*08等位基因)释放这一事实，MICA在癌症生物学中的作用变得复杂(Ashiru等人(2010)CancerRes.[癌症研究]70(2):481-489)。可溶性MICA(sMICA)可以例如在患有胃肠道恶性肿瘤的患者的血清中以高水平检测到(Salih等人，2002J.Immunol.[免疫学杂志]169:4098)。已报道，MMPADAM10和ADAM17连同二硫键异构酶Erp5在MICA的切割和脱落中起作用(Waldhauer(2008)CancerResearch[癌症研究]68(15)6368-76；Kaiser等人(2007)Nature[自然]；以及Salih(2002)J.Immunol[免疫学杂志]169:4098-4102)。已报道膜结合的MICA下调NKG2D在NK和/或T细胞上的表达(VonLilienfeld-Toal等人(2010)CancerImmunol.Immunother[癌症免疫学免疫疗法])。值得注意的是，Wiemann(2005)(同上)检查了MICATg小鼠，并得出结论，非转基因脾细胞上的表面NKG2D的下调在与来自MICA转基因小鼠的脾细胞在体外共培养之后最明显，并且仅在用来自H2Kb-MICA小鼠的血清处理后略有下调，然而，分别与对照细胞和来自nontgLM的血清一起孵育没有效果，并且总体数据表明H2-K-MICANK细胞上的表面NKG2D降低导致NKG2D功能障碍，并且NKG2D下调主要是由于持续暴露于细胞结合的体内MICA引起的。还有报道称，NK细胞上的NKG2D被sMICA下调(Groh等人(2002)Nature[自然]；Arreygue-Garcia(2008)BMC；Jinushi等人(2005)J.Hepatol.[肝病学杂志])，这导致反应性较低的NK细胞。这种基本原理可能已经出现，因为在其他蛋白质家族中已经观察到类似的系统，例如已证明Ig样和TNF超家族以可溶形式释放，并且分子的释放通过减少配体密度影响细胞-细胞相互作用并且调节携带各自受体的NK细胞(Salih2002)。因此，产生抗MICA抗体的尝试集中于开发抑制MICA脱落的抗体。还已经报道，NKG2D配体MICA和MICB在健康细胞上的表达可以打破免疫激活和耐受性之间的平衡，并引发自身免疫。遗传连锁研究已经表明，一些MICA等位基因与1型糖尿病呈正相关，并且通过用NKG2D阻断性mAb(其减弱自身反应性CD8+T细胞的扩增和功能)治疗可以完全阻止在其胰岛细胞上表达Rae1的前驱糖尿病NOD小鼠的的疾病发展。MICA和MICB分子在RA滑膜细胞中也显著上调并且以NKG2D依赖性方式激活T细胞。此外，已经报道，类风湿性关节炎患者在血清和发炎的关节中具有高水平的IL-15和TNF-α，它们诱导T细胞的CD4+CD28-亚群上的NKG2D的表达。在乳糜泻中，已经报道了肠中上皮内NKG2D+CD8+T淋巴细胞的大量浸润，并且MIC蛋白变得在患有活动性疾病的患者的上皮细胞表面上强烈表达。在炎性肠病中，在肠上皮细胞上发现MIC表达水平增加，并且发现表达NKG2D的肠上皮CD4+T细胞的数量与肠炎相关。迄今为止基于NKG2D系统治疗炎症的方法集中于阻断NKG2D本身而不是其配体(Ogasawara等人(2004)Immunity[免疫学]20(6):757-767；Andersson等人(2011)Arthritis.Rheum.[关节炎与风湿病]63(9):2617-2629；Steigerwald等人(2009)MAbs[单克隆抗体]1(2):115-127)。一种可能性是，这种对NKG2D而非其配体的关注是由于感知难以靶向NKG2D配体系统，该NKG2D配体系统包括多种配体并且在一些情况下包括大量等位基因。对于MICA和MICB，有超过97个MICA等位基因和至少31个MICB等位基因被识别。在α1α2结构域(参与NKG2D界面的结构域)中的MIC多肽中仅有43％的氨基酸同一性，并且80％的氨基酸取代是非保守的(Steinle等人(2001)Immunogenetics[免疫遗传学]53:279-287；Steinle等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]95:12510-12515)，这表明将不太可能获得对群体中的大多数个体有效的抗体。另外，MICA中第129位处的甲硫氨酸/缬氨酸双态性决定了NKG2D结合的差异，并且尽管残基129的侧链被部分掩蔽并且在第一个α2螺旋段中与谷氨酰胺136、丙氨酸139和甲硫氨酸140形成疏水相互作用，与缬氨酸129形式的MICA相比，这可能与该结构域中的构象差异有关(Steinle等人(2001)Immunogenetics[免疫遗传学]53:279-287)。总之，对用治疗剂靶向MICA的新方法存在需求。
技术实现思路
在一方面，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合人MICA多肽的单克隆抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含：(a)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.15 US 62/308,4431.一种结合人MICA多肽的单克隆抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含：(a)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或(b)包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含：包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO:7的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。3.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含：包含SEQIDNO:8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQIDNO:9的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。4.一种结合人MICA多肽的抗体或抗体片段，其中该抗体或抗体片段包含：包含与SEQIDNO:6的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及包含与SEQIDNO:7的氨基酸序列至少90％、95％或98％相同的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，其中VH在位置72c处包含赖氨酸(K)残基并且在位置74处包含谷氨酰胺(Q)残基，并且VL在位置71处包含酪氨酸(Y)，其中根据Abnum编号进行残基的编号。5.如权利要求4所述的组合物，其中VL在Abnum位置83处包含苯丙氨酸(F)。6.如权利要求4或5所述的组合物，其中VH包含在Abnum位置30处的苏氨酸(T)、在位置67处的缬氨酸(V)和在位置71处的精氨酸(R)。7.如权利要求4-6所述的组合物，其中VH在Abnum位置48处包含异亮氨酸(I)。8.如权利要求4-6所述的组合物，其中VH在Abnum位置48处包含甲硫氨酸(M)。9.如权利要求4-8中任一项所述的组合物，其中VH人受体框架来自IGHV4-b，并且J-区段来自IGHJ6。10.如权利要求4-9中任一项所述的组合物，其中VL结构域人受体框架来自IGKV3-11，并且J-区段来自IGKJ2。11.如权利要求4-10中任一项所述的组合物，其中该抗体包含：CDR-H1，其包含SEQIDNO:30的氨基酸序列；CDR-H2，其包含SEQIDNO:31的氨基酸序列；CDR-H3，其包含SEQIDNO:32的氨基酸序列；CDR-L1，其包含SEQIDNO:33的氨基酸序列；CDR-L2，其包含SEQIDNO:34的氨基酸序列；以及CDR-L3，其包含SEQIDNO:35的氨基酸序列。12.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗体与包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，与包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，与包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合，以及与包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的细胞表面MICA多肽结合。13.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中如通过流式细胞术所确定的，对结合使在其表面表达包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，对结合使在其表面表达包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，对结合使在其表面表达包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，以及对结合使在其表面表达包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的MICA多肽的C1R细胞，该抗体被表征为不超过1μg/ml或任选地不超过0.2μg/ml的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马蒂厄·布莱里，劳伦特·戈捷，
申请(专利权)人：依奈特制药公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR