胶体金层析法肝病检测试纸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了胶体金层析法肝病检测试纸，以及制备方法。本发明专利技术所述的胶体金层析法肝病检测试纸，是在ＰＶＣ塑料底板上顺次相互搭接地粘贴硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫、吸水垫而形成的膜条，硝酸纤维素膜有检测线和质控线，检测线包被Ｍ２型线粒体抗原蛋白，质控线包被抗体（ｃ），结合垫包被金标抗体（ａ）和金标抗体（ｂ）。本发明专利技术所述的试纸条引入Ｍ２型线粒体抗原蛋白，并对结合垫和样品垫进行了工艺优化，实现了对Ｍ２型抗线粒体抗体的高灵敏度、高特异、高准确性的检测性能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测肝病的 试纸及其制备方法。
技术介绍
原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrh0SiS，PBC)是以破坏肝内小及中等 大小胆管为主的器官特异性自身免疫性肝病，表现为肝门脉区炎症导致纤维化，肝硬化甚 至功能性衰竭。肝炎、肝硬化病人各种病原检测指标呈阴性，需要考虑原发性胆汁性肝硬化 或自身免疫性肝炎。早期运用药物治疗可控制疾病的进展，而PBC的治疗关键在于早期治 疗，而早期治疗的前提是早期诊断，早期诊断就成为大家所关注的焦点。在PBC患者体内可检出多种自身抗体，如抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗肝肾微粒体抗体(LKM)等，其中最主要 的抗体是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出现AMA是本病的特点。AMA于1965 年由WalRer等在PBC患者血清中用间接免疫荧光法首次发现，其后的研究显示，PBC患者的 AMA阳性率可高达90%，此项检测已成为PBC诊断的主要检查项目。(Neuberger J，Thomson R.PBC and ΑΜΑ—what is theconnection. Hepatology,1999,29(1)265-271)近年研究发现，AMA存在若干亚型，迄今已发现的亚型共有9种(Ml M9)，与PBC 有关的有4种，即M2、M4、M8、M9，其中M2亚型抗体(AMA-M2)为PBC的特异性抗体，对本病 有确诊意义。AMA-M2线粒体抗体对PBC检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达95%。 (LeungP S,Van de water J,Coppel R L.et al. Molecular aspects andthe pathoh)gi (al basis of primary biliary cirrhosisAutoimnlun,1996,9(2) :119-128.)PBC病人在出现临床症状和组织学特征变化之前几年甚至十几年就可出现M2型 抗线粒体抗体(姜小华，仲人前，孔宪涛.原发性胆汁肝硬化发病机制研究进展.中国免疫 学杂志，2002,18 =586-588) 0因此M2型抗线粒体抗体即时检出对PBC早期检出及辅助诊断 有非常重要的意义。2000年美国肝病学会(AASLD)在发表的《PBC诊断指南》中，其中有一 很重要的一项为M2亚型抗线粒体抗体(AMA-M2)阳性。随着对M2靶抗原的研究深入，鉴定出M2的靶抗原为线粒体上的2-氧酸脱氢酶复 合体〔2-0ADC〕的一些组分丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)、2-氧酸脱氢酶(BC0ADC-E2)、2_氧戊 二酸脱氢酶(0GDC-E2)、X蛋白等，而其中PDC的抗原表位主要位于内酯酰区和部分外酯酰 区，在PBC病人血清中的阳性率为95%。BC0ADC，0GDC的抗原表位位于内酯酰区，阳性率分 别为53 % 55 %，39 % 88 %。三抗原间无交叉反应，PBC病人血清中M2型抗线粒体抗体 能与一种或一种以上抗原反应。三个靶抗原联合检测，其阳性率可达95% 99%，而且特 异性也很高，正常人阳性仅为0. 5% (贾继东自身抗体检测在自身免疫性肝病诊断中的应 用.中华检验医学杂志，2003, ) 116-120)。本产品采用基因工程方法(定康，陈燕等人源M2 二联体靶抗原P0-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定· 临床军医杂志· 2007，636 (3) :323 :325.)成功克隆、原核表达全部为人源的M2三个靶抗原，即丙酮酸脱氢酶(PDC)、2_氧酸脱氢酶 (BCOADC)、2_氧戊二酸脱氢酶(OOTC)，且成功连接形成抗原蛋白三联体即为本产品的检测 抗原。目前M2型抗线粒体抗体的检测方法有间接免疫荧光 Indirectmmunofluorescence, IIF)禾口酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)。目前市场上商品化M2型抗线粒体抗体检测试剂盒主要为ELISA试剂盒。ELISA法 操作程序烦琐，完成整个实验过程需三小时左右，亦需要专业免疫学技术人员在实验室中 进行实验操作，并且需经酶标仪检测后读取实验结果，这在基层医疗机构的实验室和小型 门诊中较难实现该项目的实验检测，同时基于ELISA方法学易受各种温度和孵育时间等环 境条件因素的影响，对试验带来诸多不便。间接免疫荧光，观察结果需要专业人员操作特殊的仪器设备，间接免疫荧光法存 在检测时间长但须有荧光显微镜观察结果，并有一定的主观人为判断误差，另外易受其他 干扰产生假阳性，标准化困难，也不适合高通量标本的检测。为了克服上述检测方法的不足，我们将胶体金层析法应用到M2型抗线粒体抗 体的检测中。胶体金免疫层析法(gold-immunochromatography assay, GICA)是应用 胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，以条状纤维层析材料为固相，通过毛细效应使样 品溶液在层析条上泳动，使样品中的待测物与结合垫上针对待测物的受体(如抗原或抗 体)发生免疫反应，并与条状纤维层析材料上的抗原(或抗体)发生免疫反应而被截留， 进而形成肉眼可见的紫红色条带，得到直观的实验结果，达到快速检测的目的(Sikowicz Getal. One-step chromatographic immunoassay for qualitativedetermination of choricogonadotropin in urine. Clin Chem. 1990 (36) 1579-1586.)。使用时只将样品加样 到样品垫上，数分钟就根据检测线上紫红色条带出现情况来判断阴阳性结果。与其他检测 方法相比，检测时间短，只需要5 10分钟，操作人员无需培训，操作简便、快速，无需低温 保存，储运方便等优势。在自身免疫性疾病方面，目前国外市场上出现了一些检测自身免疫疾病的试纸条 产品，但M2型抗线粒体抗体的胶体金免疫试纸在国内外市场上仍没有问世。本专利技术将基因 工程菌表达的抗原蛋白首次引入到试纸条中，实现了高特异性、高灵敏度、高准确度的检测 性能。目前市面上也出现了商品化ELISA试剂盒，但金标层析试纸与之相比，仍有诸多不同 之处，不受场地人员之限，检测时间短即5-10分钟，判读结果简便。此外该试纸具有高特异 性、高灵敏度、高准确度，能满足市场的快速筛选PBC，为病人及早诊断治疗提供条件，同时， 也能满足基层实验室、即时检测、床边检测的需求。
技术实现思路
本专利技术为了克服以上方法学的不足，将胶体金层析法应用到M2型抗线粒体抗体 的检测中，同时首次将M2型线粒体抗原蛋白应用到胶体金层析法中，采用间接法来实现血 液中的M2型抗线粒体抗体检测，实现高特异、高灵敏度、高准确性的检测性能，快速筛选出 M2型抗线粒体抗体的阳性样本，能快速、便捷地辅助诊断原发性胆汁肝硬化。本专利技术目的之一在于提供一种胶体金层析法肝病检测试纸。本专利技术目的之二在于提供一种胶体金层析法肝病检测试纸的制备方法。一种胶体金层析法肝病检测试纸，包括有硝酸纤维素包被膜(3)、结合垫⑵、样 品垫(1)、吸水垫(6)，它们依次粘贴在底板上，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶体金层析法肝病检测试纸，包括有硝酸纤维素包被膜、结合垫、样品垫、吸水垫，它们依次粘贴在底板上，其特征在于：所述的结合垫包被有金标抗体（ａ）和金标抗体（ｂ），所述的硝酸纤维素包被膜上有检测线（Ｔ）和质控线（Ｃ），其中的检测线包被有Ｍ２型线粒体抗原蛋白，其中的质控线（Ｃ）包被有抗体（ｃ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张玥，韩永俊，高成秀，杨超文，孙宏彬，孙潇，张宇婷，钱杰，
申请(专利权)人：上海科新生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]