一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑‑白蛋白纳米颗粒的制备方法；利用白蛋白为原料，通过调整包载的吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑药物的比例及溶剂，充分控制颗粒粒径的大小，制备出粒径在20‑50纳米的颗粒；将吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑同时包载于白蛋白纳米颗粒中，使其兼具治疗和成像功能。用高效液相色谱测定体外药物释放，在磷酸盐缓冲液中，缓释96h释放度仅达到31％，具有明显的缓释作用。本发明专利技术合成过程简便，无毒，快捷，产量大,比现有技术的在颗粒的粒径上有了明显的缩小。在体外缓释试验中，吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑‑白蛋白纳米颗粒具有良好的缓释作用，在96小时释放度仅达到31％，具有缓释作用。

Preparation of trans anisole albumin nanoparticles with indocyanine green fluorescence tracer

The invention relates to a preparation method of trans-anise brain albumin nanoparticles traced by indole green fluorescence; using albumin as raw material, the particle size is fully controlled by adjusting the proportion and solvent of the encapsulated indole green fluorescent dyes and trans-anise brain drugs, and the particle size is 20 nanometers. Granule: Indole green fluorescent dye and trans-fennel were simultaneously encapsulated in albumin nanoparticles, which had both therapeutic and imaging functions. The drug release in vitro was determined by high performance liquid chromatography. In phosphate buffer solution, the release rate of sustained release for 96 h was only 31%, which had obvious sustained release effect. The synthesis process of the invention is simple, non-toxic, fast, and has large output, and has obvious reduction in particle size compared with the prior technology. In vitro sustained-release test, indole green fluorescent tracer trans-fennel albumin nanoparticles had good sustained-release effect, the release rate was only 31% in 96 hours, and had sustained-release effect.

【技术实现步骤摘要】
一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法
本专利技术涉及纳米医药
，更具体的是涉及一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法。
技术介绍
反式茴香脑是茴香油的主要成分，是天然的抗氧化剂，具有抗菌，抗真菌和麻醉特性。研究表明茴香脑可能通过抑制TNF信号、通过对PGE2和NO的产生和/或释放的抑制作用等机制有效控制一些非免疫性急性炎症相关疾病，表现出抗炎特性。在小鼠急性和持续性炎症模型中发现，反式茴香脑可降低TNF-α等细胞因子的浓度；在脂多糖(LPS)诱导的急性肺部炎症模型中，反式茴香脑也表现出对总蛋白质浓度，炎症细胞和炎症介质等的抑制作用。虽然反式茴香脑具有良好的抗炎效果，但其极强的疏水性很大程度上限制了反式茴香脑在体内的直接应用。其在目前的实验中只能溶解在二甲基亚砜、二氯甲烷、吐温-20等有机溶剂中使用，这类有机溶剂具有一定的毒性、溶解度不高，并且不能大剂量的给药使用。有学者研究尝试应用毒性较小的PEG高分子来作为反式茴香脑的助溶剂，但PEG的量超过10％小鼠就会出现溶血现象。同时反式茴香脑在肺炎的治疗中常通过灌肺给药，过程痛苦并且需要多次给药，给实验动物带来了巨大的痛苦。为了克服疏水性药物的缺点，减少有机溶剂的毒副作用并降低给药频率，人们选择采用纳米药剂来解决上述难题。纳米药剂指纳米药物颗粒是指粒径在10～1000纳米的颗粒颗粒,它可以将药物或者其他功能性分子包裹在纳米颗粒之中或修饰在其表面，并将其运输到目的部位。纳米颗粒具有载药量高、制备方法简单、毒性低并可以在体内循环长时间循环并缓慢释放药物等优点。但是目前并没有关于反式茴香脑的纳米颗粒的研究报道。白蛋白纳米颗粒作为一种绿色可降解的安全性较好纳米颗粒，可用于负载脂溶性药物。将白蛋白水溶液与溶解药物的油性溶剂高速搅拌混合形成乳液，之后加入戊二醛进行交联，最终旋转蒸发除去油相得到稳定的纳米粒。这种方法可以大量连续生产载药的白蛋白纳米颗粒。制备完成的白蛋白纳米颗粒具备可生物降解、制备容易且可重复性好等特点。为了赋予纳米颗粒示踪的效果，验证纳米颗粒可以被巨噬细胞吞噬从而发挥验证调节作用，我们还可以在颗粒制备过程中来添加有机染料来进行荧光成像。因此，研制出一种颗粒均匀、成球性好、避免有机溶剂的毒性、具有良好的缓释作用，可以有效提高反式茴香脑药物的使用效率，增强治疗效果并且可以实时跟踪纳米颗粒等优势的药物颗粒具有重大的意义，在生物技术和医药
具有重要的科研和临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术提出了一种具有粒径小，细胞毒性小，载药量相对较高并且可以实时示踪的纳米颗粒等优势的新型白蛋白颗粒的制备方法。本专利技术的技术方案包括：利用白蛋白为原料，通过调整包载的吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑药物的比例及溶剂，充分控制颗粒粒径的大小，制备出粒径在20-50纳米的颗粒；将吲哚箐绿荧光染料以及反式茴香脑同时包载于白蛋白纳米颗粒中，使其兼具治疗和成像功能。用高效液相色谱测定体外药物释放，在磷酸盐缓冲液(PH＝7.4)中，缓释96h释放度仅达到31％，具有明显的缓释作用。具体说明如下：一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法；其步骤如下：1)载药白蛋白纳米颗粒的制备：配置10～20mg/ml白蛋白水溶液2～2.5ml；2)加入用二氯甲烷、乙醇或者二甲基亚砜配置的40～60mg/ml、反式茴香脑溶液10～15μl，以及80～100mg/ml的吲哚箐绿溶液1～3μl；3)搅拌之后加入70～100μl的戊二醛交联剂水溶液，5～50℃条件下搅拌反应；4)待反应结束,用水系滤膜过滤；5)滤液离心分离，去离子水洗涤，得到吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒。优选步骤3)5～50℃条件下于600～800rpm/min搅拌反应2～6小时。优选步骤4)用220nm水系滤膜过滤。优选步骤5)滤液以6000～8,000rpm/min、离心3～6分钟。优选步骤5)去离子水洗3～6遍。本专利技术制备的包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的白蛋白纳米颗粒，直径为20～50纳米，载药率为5～8％。优选白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。将颗粒体外释药采用高效液相色谱法考察反式茴香脑一牛血清白蛋白纳米颗粒的体外释药规律,磷酸盐缓冲液作为释药介质,将原液分成多份，同时在摇床上37℃恒速摇晃,定时取样,计算释药率。本专利技术的优势在于：1)合成过程简便，快捷，无毒无污染。2)本专利技术制备出的吲哚箐绿反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的直径为20～50纳米，载药率为5～8％，细胞存活率为80％～95％。比原有技术载药量提高了4％，且粒径缩小了几百纳米，更便于在细胞以及动物体内应用。3)本专利技术制备出的颗粒可通过观察纳米载细胞内吲哚箐绿荧光染料的分布情况来实时跟踪颗粒所到达的位置。4)通过高效液相色谱HPLC测定体外药物释放，在PH＝6.5的PBS中，96小时内释放度仅达到31％，说明该颗粒具有缓释作用。附图说明图1-1：实施例1制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-2：实施例2制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-3：实施例3制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-4：实施例4制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-5：实施例5制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-6：实施例6制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-7：实施例7制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图1-8：实施例8制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜照片。图2：吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒体外药物释放与时间关系图。图3：吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒细胞毒性分析柱状图。图4-1：为细胞核DAPI染色荧光成像。图4-2：为吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒内吞荧光成像。图4-3：为两张荧光图片Merge之后的成像结果图片。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本专利技术不限于此。实施例1：1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取10mg/ml牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液15μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液2μl。3)搅拌均匀之后迅速加入100μl的戊二醛交联剂水溶液，在最后于700rpm/min，20℃条件下搅拌反应3小时。4)待反应结束,用220nm水系滤膜过滤。5)滤液以8,000rpm/min，离心4分钟，去离子水洗5遍，得到包载反式茴香脑以及吲哚箐绿的牛血清白蛋白纳米颗粒。制备吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的透射电子显微镜观察形貌(图1-1)。实施例2：1)载药牛血清白蛋白纳米颗粒的制备：取15mg/ml牛血清白蛋白水溶液2ml，超声使其均匀。2)用移液枪缓慢地加入用二氯甲烷配置的40mg/ml反式茴香脑溶液12μl，以及80mg/ml的吲哚箐绿溶液1μl。3)搅拌均本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑‑白蛋白纳米颗粒的制备方法；其特征是步骤如下：1)载药白蛋白纳米颗粒的制备：配置10～20mg/ml白蛋白水溶液2～2.5ml；2)加入用二氯甲烷、乙醇或者二甲基亚砜配置的40～60mg/ml反式茴香脑溶液10～15μl，以及80～100mg/ml的吲哚箐绿溶液1～3μl；3)搅拌之后加入70～100μl的戊二醛交联剂水溶液，5～50℃条件下搅拌反应；4)待反应结束,用水系滤膜过滤；5)滤液离心分离，去离子水洗涤，得到吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑‑白蛋白纳米颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒的制备方法；其特征是步骤如下：1)载药白蛋白纳米颗粒的制备：配置10～20mg/ml白蛋白水溶液2～2.5ml；2)加入用二氯甲烷、乙醇或者二甲基亚砜配置的40～60mg/ml反式茴香脑溶液10～15μl，以及80～100mg/ml的吲哚箐绿溶液1～3μl；3)搅拌之后加入70～100μl的戊二醛交联剂水溶液，5～50℃条件下搅拌反应；4)待反应结束,用水系滤膜过滤；5)滤液离心分离，去离子水洗涤，得到吲哚箐绿荧光示踪的反式茴香脑-白蛋白纳米颗粒。2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，杨涵，武晓丽，高俊潇，陈星濛，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12