一种重组嵌合抗原受体基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于肿瘤细胞免疫治疗领域，提供了一种重组嵌合抗原受体(CAR)基因、包含其的载体、CAR‑T细胞及其应用，所述重组CAR基因包含编码如下部分的核酸序列：CD30抗体的抗原结合部分，跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；本发明专利技术还提供了一种应用，所述的应用指将一种分离的重组核酸、一种CAR融合蛋白或一种重组T淋巴细胞用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物种的应用。

Recombinant chimeric antigen receptor gene and its application

The invention belongs to the field of cancer cell immunotherapy, and provides a recombinant chimeric antigen receptor (CAR) gene, a vector containing it, a CAR T cell and its application. The recombinant CAR gene comprises nucleic acid sequences encoding the following parts: the antigen binding part of CD30 antibody, the transmembrane part and the CD137 cells connected in any order. The present invention also provides an application of a separated recombinant nucleic acid, a CAR fusion protein or a recombinant T lymphocyte for the preparation of drugs for the treatment or adjuvant treatment of Hodgkin's lymphoma or anaplastic large cell lymphoma or other CD30-positive tumors. The application of species.

【技术实现步骤摘要】
一种重组嵌合抗原受体基因及其应用
本专利技术属于肿瘤治疗领域，具体涉及一种重组嵌合抗原受体CAR基因及其载体和其在制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。
技术介绍
霍奇金淋巴瘤(HL)是淋巴瘤的一种独特类型，为青年人中最常见的恶性肿瘤之一，据流行病学调查霍奇金淋巴瘤在世界各地的发病情况差异较大，在欧美国家多发，占淋巴瘤的45％左右，居淋巴瘤之首位，而中国和日本发病率较低，经典型霍奇金淋巴瘤的RS细胞CD30抗原表达阳性，是识别RS细胞的重要免疫标志。间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)，即是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种独立类型，由德国病理学家Stein等于1985年应用Ki-1(CD30)抗体识别，被命名为间变性大细胞淋巴瘤，在临床上ALCL被分为原发性(系统性和皮肤)及继发性(由其他淋巴瘤转化而来)两种，约占全部NHL的2％-7％。申请人致力于CAR-T研究多年，已有中国专利201610537806.3，该专利公开了一种CAR-T细胞毒性指示载体，该细胞病毒指示载体为一种重组慢病毒载体，由原始慢病毒载体和插入序列组成，当CAR-T细胞与CAR-T细胞毒性指示细胞混合后，指示细胞表达的肿瘤相关靶抗原能够靶向引导CAR-T进行结合，并裂解指示细胞，释放荧光素酶，进而通过计算指示CAR-T细胞毒性。CAR-T，全称是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞，嵌合抗原受体(CAR)由胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成，再在体外将其导入到患者的T细胞内，从而获得能够表达上述嵌合抗原受体的CAR-T细胞，然后经过纯化和体外大规模扩增后，再将上述CAR-T细胞输回患者体内行使杀灭肿瘤细胞的功能。CAR-T能将T细胞的生理功能和在非MHC限制性方式下识别表面抗原的能力结合起来，这些受体不依赖抗原加工就能识别完整的膜蛋白，CAR-T细胞疗法通过外源基因转导技术，把识别肿瘤相关特异性抗原的单链抗体片段(scFv)和T细胞活化序列的融合蛋白表达到T细胞表面，经回输患者体内后大量扩增，能够以非MHC限制性的模式表现出较强的抗肿瘤作用，然而，CAR的问题是信号通过胞质内scFv-TCRζ单一链结构域时不能完全复制多链的TCR信号复合体，因此，本领域需要开发能够增加T细胞功能和增殖的CAR基因。近几年关于CAR-T的研究越来越多，如中国专利201610327646.X采用针对CD30的CAR-T技术，公开了一种靶向CD30的复制缺陷型重组慢病毒的CAR-T转基因载体，该专利技术能显著提高细胞因子的分泌、CAR-T细胞的体外杀伤作用，临床治疗霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤效果突出，但该专利技术特异性不高且T细胞的增殖能力一般。申请人致力于CAR-T的研究多年，已有中国专利技术201610953471.3，该专利公开了一种重组CAR基因及其载体、CAR-T细胞和应用，使用该专利技术的重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T细胞的效率较高，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力，同时该专利技术的重组CAR基因对B细胞肿瘤抗原的特异性高，促使CAR-T特异性地杀伤B细胞肿瘤。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有CAR-T细胞治疗针对霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤效果不够显著，特异性不高且T细胞的增殖能力不足的问题，提供一种重组嵌合抗原受体基因及其应用。使用该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T淋巴细胞的效率高，且经转染后的阳性T淋巴细胞具有较好的增殖能力，本专利技术利用CD30抗体抗原结合部分构建的重组CAR表达于T细胞表面，可特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞。本专利技术所述重组CAR基因对CD30阳性肿瘤特异性高，促使CAR-T特异性杀伤例如霍奇金淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤。本专利技术通过如下技术方案以实现上述目的：一方面，本专利技术提供了一种分离的重组核酸，命名为CAR重组基因，其编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的重组核酸任选还包含编码信号肽的核苷酸序列。另一个方面，本专利技术提供了一种CAR融合蛋白，其包括：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；再一方面，本专利技术提供了一种重组T淋巴细胞，其具有包括如下部分的融合多肽。CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。再一个方面，本专利技术提供了一种应用，所述的应用指将一种分离的重组核酸、一种CAR融合蛋白或一种重组T淋巴细胞用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用；所述的重组核酸编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的CAR融合蛋白包括：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区；所述的重组T淋巴细胞具有包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分、以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。再一个方面，本专利技术还提供本专利技术所述的CAR重组基因编码的融合多肽。再一个方面，本专利技术还提供包含本专利技术所述CAR重组基因的载体，所述的载体包括表达载体、质粒、慢病毒和逆转录病毒载体等。本专利技术的载体可以是慢病毒质粒载体，如pLent-EF1a，也可以是慢病毒载体，如山东维真生物科技有限公司的LT88001载体。再一个方面，本专利技术提供了一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括将T淋巴细胞用本专利技术所述的CAR重组基因或包含其的重组载体、或本专利技术所述的CAR融合蛋白转化。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1.本专利技术提供了一种重组嵌合抗原受体基因，使用该重组CAR基因及含有该重组CAR基因的载体转染T淋巴细胞的效率高，且经转染后的阳性T淋巴细胞具有较好的增殖能力。2.本专利技术利用CD30抗体抗原结合部分构建的重组CAR表达于T细胞表面，可特异性地杀伤CD30阳性的肿瘤细胞。3.本专利技术提供的重组CAR基因，以及包含所述重组CAR基因的载体和用所述重组CAR基因或包含所述重组CAR基因的载体转化得到的T细胞对CD30阳性肿瘤的特异性高，将所述的重组CAR基因通过AsisI/NsiI双酶切连入慢病毒质粒载体pLent-EF1a中，构建CART-30scFv质粒，利用该质粒进行慢病毒包装和纯化，通过慢病毒载体技术将重组CAR基因表达于患者T细胞，所述的CAR-T细胞的转染率高，可达到64.7％，且经转染后的阳性T细胞具有较好的增殖能力，经体外约2周扩增后，CD3阳性T细胞增加560倍。4.CD30阳性霍奇金淋巴瘤志愿患者经含有本专利技术重组CAR3基因的CAR-T细胞治疗后，疗效显著，症状完全缓解率高达70％。附图说明图1为实施例1构建的CART-30scFv质粒图谱。图2为实施例1构建的pLent-EF1a的质粒图谱。图3为实施例2中感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CAR重组基因，其特征在于：所述的CAR重组基因的编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。

【技术特征摘要】
1.一种CAR重组基因，其特征在于：所述的CAR重组基因的编码包含如下部分的多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。2.一种CAR融合蛋白，其特征在于：包括CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。3.一种重组T淋巴细胞，其特征在于：包括如下部分的融合多肽：CD30抗体的抗原结合部分、跨膜部分以及以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3zeta胞浆功能区。4.一种将如权利要求1所述的CAR重组基因用于制备治疗或辅助治疗霍奇金病淋巴瘤或者间变性大细胞淋巴瘤或者其他CD30阳性肿瘤的药物中的应用。5.一种将如权利要求2所述的CA...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，
申请(专利权)人：宜明细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11