一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL‑2RG缺陷基因的方法，通过获得pAAV‑AAVS1Donor载体和pAAV‑SaCas9‑gRNAAAVS1载体用于修复IL‑2RG缺陷基因，通过将其共同注入X‑SCID宿主细胞后，pAAV‑SaCas9‑gRNA AAVS1载体中的CRISPR/Cas9系统将宿主细胞中缺陷IL‑2RG基因进行切割，并采用同源重组修复机制将pAAV‑AAVS1Donor载体中正确的IL‑2RG基因准确地插入到基因组中，本发明专利技术利用CRISPRCas9系统同源重组修复IL‑2RG缺陷基因的方法,实现了X‑SCID精准治疗的突破。

A method of repairing IL-2RG defective gene by homologous recombination of CRISPR/Cas9 system

The invention discloses a method for repairing IL_2RG defective gene by homologous recombination of CRISPR/Cas9 system. By obtaining pAAV_AAVS 1 Donor vector and pAAV_SaCas9_gRNAA AVS 1 vector, the defective gene of IL_2RG is repaired. After being injected into X_SCID host cells, the CRISPR/Ca of pAAV_SaCas9_gRNA AAVS 1 vector is obtained. The S9 system cuts the defective IL_2RG gene in the host cell and accurately inserts the correct IL_2RG gene in the pAAV_AAVS 1 Donor vector into the genome by homologous recombination repair mechanism. The invention utilizes the CRISPRCas9 system to repair the defective IL_2RG gene by homologous recombination and realizes a breakthrough in the precise treatment of X_SCID.

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法。
技术介绍
原发性免疫缺陷病(Primaryimmunodeficiencydiseases，PID)是因免疫系统遗传缺陷或先天发育不全引起免疫功能障碍所致的易患感染、恶性肿瘤和自身免疫性疾病的一组疾病，目前已发现有200多种基因突变导致PID，并且每年均有十余种新的PID病种被发现，尽管单个PID病种发病率低，但病情危重、预后差，而且整体发病率不低，我国每年新发PID患儿可达上千例。重症联合免疫缺陷病(severecombinedimmunodeficiency，SCID)是最严重的一种PID类型，是一组严重威胁儿童健康的疾病，发达国家已将其纳入新生儿筛查的范围，SCID是由多种基因缺陷引起以T淋巴细胞缺乏或功能异常，伴或不伴有B淋巴细胞和NK细胞数量减少或功能缺陷为特征的一组疾病，其中约50％是X连锁重症联合免疫缺陷病(X-SCID)，是IL-2受体共同γ链(IL-2RG)基因突变导致的严重威胁生命的遗传性免疫缺陷病，绝大多数患儿在1岁之内死亡，造血干细胞移植是目前国际上X-SCID主要的根治性治疗手段，但是由于完全配型的供者难寻和移植前重症感染，包括我国法定新生儿期接种的BCG疫苗感染，和移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)等原因导致我国造血干细胞移植的成功率极低，全国尚未报道的资料显示仅约5％-10％(1-2/13)左右X-SCID患儿通过造血干细胞移植存活下来，基因治疗解决了配型难题，治疗后移植物抗宿主病的发生率大大减少。中国专利CN201610819040.8公开了一种先天性免疫缺陷基因治疗载体构建方法及其用途，其构建了具有高启动子活性的SIN-LV-IL2RG载体，利用安全性更高的SIN-LV载体，构建IL-2RG过表达的SINLV病毒载体，并将SIN-LV过表达IL-2RG感染大鼠模型(IL-2RG基因敲除大鼠模型)，通过分析大鼠模型的症状变化，可以对基因治疗X-SCID的有效性做出准确的评估，但是病毒载体的免疫原性强、体内表达时间短和随机插入发生肿瘤的风险会阻碍基因治疗临床的广泛应用。基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等，而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因，CRISPRCas9技术可以通过guideRNA靶向结合目标DNA序列并进行定点切割，通过同源重组修复(homology-directedrepair，HDR)或者非同源末端连接(NHEJ)在基因断裂处进行修复，因此提高了基因编辑的特异性和效率，为遗传性疾病，尤其是X-SCID的精准治疗带来了希望。目前，CRISPR/Cas9系统的应用主要有如下实例：例如，中国专利CN201510198437.5利用CRISPR/CAS9基因组编辑技术，构建人类遗传性心肌病多能干细胞，此专利技术的人类遗传性心肌病的疾病心肌细胞具备与人类遗传性心肌病患者心肌细胞相似的疾病表型及电生理改变，来源广泛，且能长期体外培养。又例如，中国专利CN201610005683.9公开了一种对凝血因子F8/F9进行原位修复的方法，选定凝血因子基因的突变位点为原位修复的基因位点，设计CRISPR/Cas系统的sgRNA序列的核酸酶的结合位点，将同源重组供体序列插入到基因原位修复位点内，修复基因或补充基因的表达,此专利技术方法对于凝血因子突变位点的原位修复指明了研究方法和临床应用的可能性。再例如,中国专利CN105985985A利用CRISPR/Cas9技术清除异体间充质干细胞表面导致免疫排斥的抗原以及引起炎症反应的炎症因子，并提高间充质干细胞的抗凋亡能力、促进其归巢，为临床治疗心血管疾病的药物的制备提供一套新的技术方案，所制备的异体间充质干细胞移植后不会引起免疫排斥。虽然，CRISPR/Cas9系统目前有诸多其他应用实例，然而目前并没有利用CRISPR/Cas9系统修复IL-2RG缺陷的应用，这是由于载体序列、具体实验参数的诸多变量都会对修复效果存在影响，目前也没有任何技术指导用于解决这些问题。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法，本专利技术通过获得pAAV-AAVS1Donor载体和pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体用于修复IL-2RG缺陷基因。通过将其共同注入宿主细胞，pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体中的CRISPR/Cas9系统将宿主细胞中缺陷IL-2RG基因进行切割，并采用同源重组修复机制将pAAV-AAVS1Donor载体中正确的IL-2RG基因准确地插入到基因组中。本专利技术通过以下技术方案实现：一方面，本专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的系统，所述的系统包括两个载体，其中一个载体上含有CRISPR/Cas9系统，另一个载体上含有正确IL-2RG基因；所述的含有CRISPR/Cas9系统的载体命名为pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述的含有正确IL-2RG基因的载体命名为pAAV-AAVS1Donor载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述系统中的pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体用于提供CRISPR/Cas9系统，切割宿主细胞中的缺陷IL-2RG基因；pAAV-AAVS1Donor载体作为供体提供正确的IL-2RG基因，采用同源重组修复机制将其准确地插入到基因组中。另一方面，本专利技术提供了一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法，所述的方法为：利用含有CRISPR/Cas9系统的pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体和含有正确IL-2RG基因的pAAV-AAVS1Donor载体修复IL-2RG缺陷基因；其中pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，pAAV-AAVS1Donor载体的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。所述的方法具体为利用含有CRISPR/Cas9系统的pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体切割宿主细胞中的缺陷IL-2RG基因；以含有正确IL-2RG基因的pAAV-AAVS1Donor载体作为供体提供正确的IL-2RG基因，采用同源重组修复机制将其准确地插入到基因组中。更具体地，所述的方法包括以下步骤：(1)获得pAAV-AAVS1Donor载体和pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体；(2)将pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体和pAAV-AAVS1Donor载体共同导入宿主细胞。上述步骤(1)获得pAAV-AAVS1Donor载体的方法可以为采用本领域常规使用的任何方法获得该载体，例如全序列合成、聚合酶链式反应(PCR)或通过商业途径购买等。上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL‑2RG缺陷基因的方法，其特征在于：通过获得pAAV‑AAVS1 Donor载体和pAAV‑SaCas9‑gRNA AAVS1载体用于修复IL‑2RG缺陷基因，并将其共同注入带有IL‑2RG缺陷基因的宿主细胞后，pAAV‑SaCas9‑gRNA AAVS1载体中的CRISPR/Cas9系统将宿主细胞中缺陷IL‑2RG基因进行切割，并采用同源重组修复机制将pAAV‑AAVS1 Donor载体中正确的IL‑2RG基因准确地插入到基因组中。

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的方法，其特征在于：通过获得pAAV-AAVS1Donor载体和pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体用于修复IL-2RG缺陷基因，并将其共同注入带有IL-2RG缺陷基因的宿主细胞后，pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体中的CRISPR/Cas9系统将宿主细胞中缺陷IL-2RG基因进行切割，并采用同源重组修复机制将pAAV-AAVS1Donor载体中正确的IL-2RG基因准确地插入到基因组中。2.一种利用CRISPR/Cas9系统同源重组修复IL-2RG缺陷基因的系统，所述的系统包括两个载体，其中一个载体上含有CRISPR/Cas9系统，另一个载体上含有正确IL-2RG基因，所述的含有CRISPR/Cas9系统的载体命名为pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述的含有正确IL-2RG基因的载体命名为pAAV-AAVS1Donor载体，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.权利要求1-2中所述的pAAV-SaCas9-gRNAAAVS1载体用于提供CRISPR/C...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，吴向萍，
申请(专利权)人：宜明细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11