转基因猪的培育方法和应用技术

本发明专利技术公开一种转基因猪的培育方法。所述转基因猪的培育方法至少包括将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使其诱导为RNA诱导性多能干细胞；在Cas9‑gRNA和CRE同源重组酶的作用下，敲除猪有毒基因的同时敲入若干个人基因片段，采用人源vWF基因原位替换猪内源vWF基因，获得PERV病毒灭活、且无人免疫排斥和凝血不兼容的基因；筛选出没有脱靶效应的干净中靶细胞系并将其培养成猪体细胞；采用体细胞核转移技术处理猪体细胞获得转基因猪。本发明专利技术获得的转基因猪具有PERV病毒永久性无法表达、对人体无免疫排斥和凝血兼容等优点，可用作人异源器官、组织、细胞的供体。

* breeding methods and application of transgenic pigs

【技术实现步骤摘要】
转基因猪的培育方法和应用
本专利技术涉及转基因
，尤其涉及一种转基因猪的培育方法和应用。
技术介绍
器官移植是人体晚期器官衰竭的一种有效治疗手段，但是严重受限于供体器官的短缺，每年大量的人在等待器官的时候死去。此外，高昂的器官移植费用也限制了人体器官移植手术实施的数量。在解决供体器官数量以及器官移植费用方面，人们想到了异源移植，也就是考虑采用其他动物的相应器官移植至需要器官移植的人体内。在众多的动物器官中，猪器官的大小及生理功能同人相仿，因此，被公认为异种移植的最佳供体。但是，猪中存在猪内源性逆转录病毒(Porcineendogenousretrovirus，PERV)，这种PERV病毒是一种整合在猪基因组中的逆转录病毒，存在每个猪细胞中，并可以进入猪生殖细胞系稳定遗传。猪细胞可以释放病毒感染多种类型的人细胞，因此，PERV感染问题已经成为临床异种器官移植的主要问题。此外免疫排斥和凝血不兼容亦是临床异种移植的重要障碍。猪的每个细胞都表达半乳糖抗原，会被人血中预存的抗体识别，并激活人补体系统，导致植入人体内的猪体移植物在数分钟和数小时内被排斥而失去功能。同时猪和人的凝血系统存在不兼容，例如人的血小板会被猪源的vWF因子识别而激活，导致人接受猪体移植物后的凝血异常，在人体内发生弥漫性血管内凝血而危及病人的生命。上述障碍发生的根源在于猪的基因组序列同人的基因组存在巨大差异，在猪用于临床移植之前或者其他应用前必须对其进行基因改造，必须敲除有毒基因和敲入相应的人源性基因。为解决目前猪体移植物存在的上述问题，申请号为200680012602.2的中国专利提供一种繁育不携带传染性微生物且PERV的拷贝数在0～30之间的猪种群的方法，具体为(a)筛选具有有益的微生物谱的雄性和雌性的奥克兰岛猪；(b)将(a)筛选的雄性和雌性猪进行交配；(c)筛选(b)产生的携带有益微生物谱且PERV的拷贝数在0～30之间的后代；由此，将(c)筛选的后代适合用于异种移植。该方法采用生物优生优育的生物进化方式获得携带有有益微生物谱且PERV的拷贝数在0～30的猪作为异种移植的主体，这种方式并不能彻底避免PERV发生变异而表达，而且筛选过程繁琐复杂。而申请号为201510489709.7的中国专利申请提供一种低表达或不表达PERV的肝细胞的制备方法，具体采用如下方式获肝细胞，(1)分别制备含有应用于RNA干扰技术的siRNA的重组载体、应用于CRIPRS/Cas9技术的gRNA的重组载体和含有应用于所述CRIPRS/Cas9技术的Cas9的载体；(2)将所述三种载体共同转染至猪体细胞，培养所述经转染的猪体细胞，筛选并鉴定以获得单克隆转基因猪体细胞；(3)利用体细胞核移植技术获得含有所述转基因猪体细胞的核基因的转基因猪；(4)提取所述转基因猪的肝细胞。该方法通过RNA干扰技术和CRIPRS/Cas9技术相结合，既实现了对PERV的转录前敲除，又抑制了PERV的转录后表达，有效降低了转基因猪体细胞的PERV的活性。但是，首先，这种方法获得的肝细胞，将多个gRNA和Cas9蛋白的DNA载体转染入猪细胞随机破坏PERV的序列，一方面通过此方法敲除PERV序列是完全随机并不可预测的，有可能会在基因组中产生新突变，另一方面，由于猪基因组中PERV序列存在多个拷贝数(甚至高达40多个拷贝)，此方法并不能彻底敲除所有PERV拷贝。siRNA在此专利中采用的是质粒载体瞬时表达的方法，此方法无法永久抑制PERV的转录后表达，并且siRNA并未整合入猪基因组，因此无法遗传给后代。此专利只是降低PERV表达或者可能达到不表达的效果，但会导致生物安全事故；其次，无法克服移植过程中存在的人免疫和凝血不兼容困难；第三，这种方法在核转移过程中，成纤维细胞由于端粒长度的极限和细胞老化等问题，增生和分裂能力相当有限，克隆率低下，无法进行复杂的基因编辑，导致对猪细胞的基因改造不彻底。此外，当前进行克隆猪制备时，主要依赖猪原代成纤维细胞的核转移方法进行克隆，也就是在体外重构胚胎后植入代孕母猪。但是，这种方法中，猪的原代成纤维细胞由于端粒长度的极限以及存在细胞老化等问题，增生和分裂的能力相当的有限，因此并不能进行复杂的基因编辑。而猪的诱导性多能干细胞(induciblepluripotentstemcells，iPS)具有无限增生的能力，也有现在生产活猪个体的能力，但是，目前的猪iPS进行克隆时，形成胚胎的效率极低，其主要原因在于目前的猪iPS是通过慢病毒方法导入细胞重编程的开关基因(如Oct4、Sox2、Klf4、Nanog、Lin28)而制备，这种方法将这些重编程的开关机因随机插入细胞的基因组，拷贝数无法预测，并且永久表达，使得猪iPS永久性出于多潜能干性状态，无法形成胚胎。而且猪iPS或者成纤维细胞在核转移过程中由于囊胚注射后大部分细胞很快出现凋亡，克隆率低。
技术实现思路
本专利技术针对现有人-猪异体移植物存在的PERV病毒表达、人免疫排斥及凝血不兼容等问题，以及现有解决上述问题中筛选过程繁琐、克隆率低下、基因改造不彻底、猪iPS无法形成胚胎等问题，提供一种转基因猪的培育方法。进一步地，本专利技术还提供上述转基因猪的培育方法培育的转基因猪的用途。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种转基因猪的培育方法，至少包括以下步骤：步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使所述猪原代体细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；步骤S02.在Cas9-gRNA的作用下将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以达到破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路蛋白的基因，记为基因I；步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞；步骤S06.采用体细胞核转移技术处理所述猪体细胞获得转基因猪。相应地，一种猪器官或组织或细胞，所述猪器官或者组织或者细胞取自如上所述的转基因猪的培育方法培育得到的转基因猪中。以及，所述猪器官或组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因猪的培育方法，其特征在于，至少包括以下步骤：步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使所述猪原代成纤维细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；步骤S02.在Cas9‑gRNA的作用下将Loxp‑Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路蛋白的基因，记为基因I；步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞；步骤S06.采用体细胞核转移技术处理所述猪体细胞获得转基因猪。...

【技术特征摘要】
1.一种转基因猪的培育方法，其特征在于，至少包括以下步骤：步骤S01.将猪原代体细胞导入信使RNA编码的细胞重编程开关基因和/或miR302/367簇，使所述猪原代成纤维细胞被诱导为RNA诱导性多能干细胞；步骤S02.在Cas9-gRNA的作用下将Loxp-Lox2272序列插入猪基因组全部PERV催化序列拷贝、猪半乳糖抗原基因9号外显子区域、猪Asgr基因2号外显子区域、猪CMAH基因4号外显子区域、猪b4GalNT2基因2号外显子区域以破坏猪基因组PERV病毒序列、猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因，同时插入人源基因的位点并在CRE同源重组酶的作用下，将组装有人补体调节蛋白的一个第一DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中多个猪基因组PERV病毒催化区中的一个拷贝序列，将组装有人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白的一个第二DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪半乳糖抗原基因表达区，将组装有人自然杀伤细胞激活通路负性蛋白的一个第三DNA载体导入所述RNA诱导性多能干细胞中猪内猪Asgr基因表达区，获得敲除猪半乳糖抗原基因、猪Asgr基因、猪CMAH基因、猪b4GalNT2基因且敲入人补体调节蛋白、人免疫细胞激活通路负性蛋白、凝血激活通路负性调节蛋白、人巨噬细胞激活通路负性蛋白、人自然杀伤细胞激活通路蛋白的基因，记为基因I；步骤S03.采用人源vWF基因原位替换基因I中的猪内源vWF基因；步骤S04.采用猪全基因测序工具筛选出步骤S03获得的没有脱靶效应的干净中靶细胞系；步骤S05.将所述干净中靶细胞系培养成猪体细胞；步骤S06.采用体细胞核转移技术处理所述猪体细胞获得转基因猪。2.如权利要求1所述的转基因猪的培育方法，其特征在于：所述第一DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡勇，于寅，
申请(专利权)人：铸造生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44