一种用于氨基酸检测的方法及其应用技术

本申请公开了一种用于氨基酸检测的方法及其应用。本申请用于氨基酸检测的方法，包括利用LC‑MS/MS对经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解的待测样品进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；质谱扫描采用MRM技术；复溶液为浓度0.1％‑5％的甲酸水溶液；流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％‑0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。本申请的方法，不需氨基酸衍生处理，所需样品量少，操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好，可同时检测43种氨基酸，效率高；并且，可用于动植物组织、细胞、血清、血浆、唾液等样品检测，适用范围广。

A method for amino acid detection and its application

The invention discloses a method for amino acid detection and its application. The method applied for the determination of amino acids includes LC MS/MS for the detection of samples dissolved in compound solution after extraction and separation of amino acids. The mobile phase used for liquid chromatography separation consists of water phase and organic phase; the mass spectrometry scanning adopts MRM technology; the complex solution is a 0.1%5% formic acid aqueous solution; The aqueous phase consists of 0.1% formic acid, 0.05% sevofluorobutyric acid and water. The organic phase consists of 0.1% formic acid, 0.01% sevofluorobutyric acid and organic solvent. The method is simple, specific, sensitive and stable. It can simultaneously detect 43 kinds of amino acids with high efficiency. It can also be used for the detection of animal and plant tissues, cells, serum, plasma, saliva and other samples with a wide range of applications.

【技术实现步骤摘要】
一种用于氨基酸检测的方法及其应用
本申请涉及氨基酸检测领域，特别是涉及一种用于氨基酸检测的方法及其应用。
技术介绍
氨基酸是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。氨基酸在体内有许多重要的功能，包括调节肌肉和激素的活性，形成和维持身体的每一个组织，如骨、韧带、肌腱、肌肉等。氨基酸几乎在每一个化学过程都发挥着重要作用，影响生理和心理功能。一部分氨基酸被认为是必不可少的，称为必需氨基酸，我们的身体自身不能合成，因此必须从饮食中摄取。当氨基酸供给不足，无法满足组织需求，重要的生理功能也会受到影响。这会导致从免疫系统效应到心血管疾病，甚至情绪障碍以及其它更多的症状和体征。氨基酸除了作为合成蛋白质的基本单位，它在细胞中还起到调控功能，这对生长、发育及人体健康来说至关重要。检测氨基酸是否充足、氨基酸水平是否平衡以及氨基酸之间的转化能力，这在预防疾病和从根本上防治很多慢性病具有重要意义。由于氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质，在分析过程中，检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用。准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。现有的氨基酸分析和检测，按分离方法分可分为纸色谱法、反相高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等；按检测方法分可分为化学分析法、电化学方法、分光光度法等；按衍生反应的先后，可分为柱前衍生和柱后衍生法。现有这些方法或检测仪器，通常需要检测氨基酸的紫外可见光谱吸收、荧光或化学发光；多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱，自身又无荧光，因此不能直接检测，需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性；检测荧光或化学发光同样也需要衍生化处理来实现。因此，现有的检测方法中，毛细管电泳分析氨基酸费时、费力，且重现性差；而气相、液相色谱用于氨基酸检测需要衍生化处理，衍生反应干扰多、专一性差。现有的氨基酸LC-MS检测的方法能检测的氨基酸数目在20种左右，在生物体内被修饰的氨基酸由于含量低而无法定量，检测更多氨基酸时多会进行繁琐的前处理衍生化反应。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种改进的氨基酸检测的方法及其应用。为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：本申请公开了一种用于氨基酸检测的方法，包括利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，其中待测样品经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解后制成上样液进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；并且质谱扫描采用MRM技术；复溶液为浓度0.1％-5％的甲酸水溶液；流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％-0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。优选的，七氟丁酸的浓度为0.05％。需要说明的是，LC-MS/MS是指液相二级质谱，即液相色谱与二级质谱联用，MRM技术是指质谱多反应监测(multiplereactionmonitoring，MRM)。本申请关键在于，采用LC-MS/MS对待测样品进行检测，并特别研制了复溶液和流动相。其中，本申请特定浓度的七氟丁酸流动相，能够有效的对多种氨基酸进行分离，改变色谱行为，使得本申请的检测方法能够检测出更多的氨基酸，本申请的一种实现方式中一次可以同时检出43种氨基酸，提高了氨基酸的检测效率；在研究过程中发现，七氟丁酸浓度会影响色谱强度和分离度，因此，必须在合适的范围内，才能达到氨基酸的有效检测和分离。此外，还需要说明的是，小分子物质由于分子量小，在esi或者apci的离子源模式下，习惯产生1电荷的离子，而2电荷的离子相对较少，但是在本申请的研究过程中发现，在现有的色谱条件下，Hcy内标对带1个电荷的离子响应较差，带2个电荷的离子恰好有良好的响应；除了Hcy内标以外的氨基酸，包括Hcy都是带1个电荷的离子有高的响应。因此，本申请的优选方案中，对Hcy内标进行二级质谱检测时，采用的母离子选择带两个电荷的离子。优选的，有机溶剂为甲醇或乙腈。优选的，氨基酸提取分离，包括沉淀蛋白提取氨基酸的处理，所采用的试剂为酸和/或有机溶剂，沉淀蛋白后，采用过滤或者离心，提取含有氨基酸的滤液或上清液。优选的，本申请的方法还包括对滤液或上清液进行浓缩干燥获得氨基酸，然后再采用复溶液溶解。优选的，在对待测样品进行氨基酸提取分离之前，还包括对待测样品进行碾碎、研磨，然后再进行氨基酸提取分离。本申请的再一面公开了本申请的方法在氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中的应用。本申请的再一面公开了一种氨基酸检测系统，该氨基酸检测系统中采用了本申请的方法。本申请的再一面公开了一种氨基酸检测平台，该氨基酸检测平台中采用了本申请的方法。本申请的再一面公开了一种氨基酸检测装置，该氨基酸检测装置中采用了本申请的方法。本申请的再一面公开了一种氨基酸检测试剂盒，该氨基酸检测试剂盒中采用了本申请的方法。需要说明的是，本申请的氨基酸检测方法，第一，能够同时对43种氨基酸进行检测，检测效率高；第二，不需要进行衍生处理，检测方便，耗时短，本申请的一种实现方式中，上机时间14min，就可以同时检测43种氨基酸；第三，需要的样本量少，操作简单，并且特异性强、灵敏度高、稳定性好。因此，本申请的检测方法完全可以用于现有的氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中，替换现有的检测方法。由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：本申请的氨基酸检测方法，不需要对氨基酸进行衍生处理，所需样品量少，并且，操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好，在较短时间内就可以对43种氨基酸进行同时检测，检测效率高。此外，本申请的方法可以用于动植物组织、细胞、血清、血浆、唾液等样品的检测，适用范围广。本申请为氨基酸检测提供了一种快速、高效、灵敏、特异、简单且稳定的新方法和途径。附图说明图1是本申请实施例中采用本申请的方法检测43种氨基酸组成的标准品的检测结果；图2是本申请实施例中采用传统方法检测43种氨基酸组成的标准品的检测结果；图3是本申请实施例中采用本申请的方法检测磷酸丝氨酸的检测结果；图4是本申请实施例中采用传统方法检测磷酸丝氨酸的检测结果。具体实施方式LC-MS/MS是近年发展起来的联用技术，在药物及体内药物分析、兴奋剂和毒品检测、农药或兽药残留量分析等领域都有应用。本申请将其用于氨基酸检测，并且特别研制了适用于氨基酸样品的复溶液和流动相。现有的氨基酸检测方法，由于部分氨基酸的检测灵敏度较低，或者需要进行衍生化，或者由于不能实现色谱的良好分离，不能进行检测；因此，现有的氨基酸检测方法只能检出20种左右的氨基酸。而本申请的检测方法，通过特别研制的复溶液和流动相，能够让氨基酸有良好的基线分离，能够检出更多的氨基酸。此外，MRM选择1个或者2个离子对是结合液相方法下选择最优的，通常大部分的氨基酸检测都是采用1个电荷的离子；但是，例如Hcy内标对带1个电荷的离子响应较差，带2个电荷的离子恰好有良好的响应。因此，本申请的氨基酸检测方法能够检出43种氨基酸。本申请的氨基酸检测方法，不需要进行衍生化处理，需要的样本量少，操作简单，本专利技术特异性强，灵敏度高，稳定性好，上机时间14min，就可以同时检测43种氨基酸。本申请的检测方法，适合于植物动物组织、细胞、血清、血浆等常见的生物样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于氨基酸检测的方法，其特征在于：包括利用LC‑MS/MS对待测样品进行检测，其中待测样品经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解后制成上样液进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；并且质谱扫描采用MRM技术；所述复溶液为浓度0.1％‑5％的甲酸水溶液；所述流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％‑0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。

【技术特征摘要】
1.一种用于氨基酸检测的方法，其特征在于：包括利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，其中待测样品经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解后制成上样液进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；并且质谱扫描采用MRM技术；所述复溶液为浓度0.1％-5％的甲酸水溶液；所述流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％-0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇或乙腈。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸提取分离，包括沉淀蛋白提取氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱雪梅，訾金，饶维桥，杨平，王道明，李彦涛，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44