动物线粒体DNA的纯化方法技术

本申请涉及一种动物线粒体DNA的纯化方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法技术领域。将待检测动物组织中加入裂解液，研磨成浆后常温离心，取上清液加入到DNA结合柱进行纯化，所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇亲水性树脂，裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化，纯化完毕的DNA结合柱加入灭菌水中，静置并常温离心，即可得到待检测动物的线粒体DNA；所述裂解液中蛋白酶K和RNase A的浓度分别为20μg/mL、10μg/mL，裂解温度为37℃，裂解时间为5min‑3h。将本申请应用于肉源的鉴定，具有操作简便、获取率高、成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】
动物线粒体DNA的纯化方法
本申请涉及一种动物线粒体DNA的纯化方法，属于包含酶或微生物的测定或检测方法

技术介绍
动物细胞中的DNA分布于两种细胞器，一种是细胞核，另一种是线粒体。通常所说的基因组DNA是指核DNA，线粒体DNA则是线粒体中含有的DNA。传统的细胞核DNA提取方法是使用裂解液将切碎的动物组织进行研磨匀浆后进行长时间的蛋白酶K消化（55℃/3h或者37℃/12h），以释放细胞核染色质中的DNA，然后再通过酚/氯仿抽提法收集含有DNA的水相，最后通过加入乙醇或异丙醇使DNA发生沉淀，获得细胞中含有的全部DNA。线粒体DNA则是将动物组织进行研磨匀浆，释放细胞中的线粒体，先是粗提线粒体，再通过超速离心机纯化线粒体，然后再进行酚/氯仿抽提和乙醇或异丙醇沉淀法获得线粒体DNA。上述方法操作周期大约为8h，同时操作过程对技术要求较高，否则就会存在大量的损耗，因而，并不适用于日常纯化提取。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有DNA获取纯化中所存在的上述缺陷，本申请提供一种操作便捷、获取率高、成本低廉的动物线粒体DNA的纯化方法。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：动物线粒体DNA的纯化方法，将待检测动物组织中加入裂解液，常温研磨成浆后离心，取上清液加入到DNA结合柱进行纯化，所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇（DEAE）亲水性树脂，裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化，纯化完毕的DNA结合柱中加入灭菌水，静置并常温离心，即可得到待检测动物的线粒体DNA；所述裂解液中蛋白酶K和RNaseA的浓度分别为20μg/mL、10μg/mL，裂解温度为37℃，裂解时间为5min-3h。进一步的，作为优选：所述裂解液的处理时间为5-20min。所述DNA结合柱的结合时长为1-40min。所述裂解液的构成为：150mMNaCl；10mMTris-HCl，pH8.0；10mMEDTA；0.1%SDS；20μg/mL蛋白酶K；10μg/mLRNaseA。更优选的，所述NaCl预热至55℃，加入对应比例的蛋白酶K和RNaseA现配形成裂解液。所述研磨匀浆时，先将待检测动物组织剪成块，加入裂解液，研磨完毕后，再进行上下匀浆10-15次。所述纯化方法包括以下步骤：①在待检测动物组织中加入裂解液，研磨匀浆后，于37℃裂解，然后常温离心；②取离心上清液置于离心管中，加入凝胶回收试剂盒的BufferG；③取质粒回收试剂盒的DNA结合柱置于收集管中，并加入步骤②中制备的溶液，常温离心，弃掉收集管中的液体；此步骤再重复一次；④加入凝胶回收试剂盒中的WS，常温离心，弃掉收集管中的液体；⑤加入凝胶回收试剂盒的WG，常温离心，弃掉收集管中的液体；此步骤再重复一次；⑥将DNA结合柱放回收集管中，常温离心；⑦迅速将DNA结合柱移至离心管中，加入灭菌水，静置后常温离心，即获得动物组织的线粒体DNA。本申请的工作原理和有益效果分析如下：（1）本申请借助于裂解液与DNA纯化柱的配合，不仅实现了DNA的快速纯化，还实现了经济又快速获得动物大量基因片段的方法。在此过程中，团队成功克隆多个华南虎的基因片段，并根据与DNA数据库中的数据比对结果，设计多对引物，发现其中部分引物只能在华南虎的模板中获得清晰的PCR产物，通过严密的实验设计和实施，确定了有两组引物可用于虎肉、虎毛等虎源组织的鉴定。该检测方法从收到检测样品开始，只需要2.5个小时2h即可完成鉴定，是至今为止最为快速的检测方法。该方法可实现快速有效检测平台的搭建，并可立即用于虎源组织鉴定的实际和生产，为海关执法、鉴别野生动物来源、对野生动物进行更好的保护等提供了有利的技术支撑。（2）本申请对不同处理温度和时间进行实验，DNA浓度检测和qPCR检测结果表明，获得的总DNA的总量没有显著差异，线粒体DNA的浓度也无统计学上的差异。该实验重复多次，在所测试的样品中均十分成功，再现性良好。这个实验表明将动物组织研磨匀浆并进行37℃进行较短时间处理即可进行抽提DNA，完成该实验的时间较短，再加上PCR的80min，动物肉源性鉴定可在2h内完成。（3）通过酚/氯仿抽提法，纯化动物组织DNA在2h内完成。而本申请在进行纯化DNA时，纯化柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇（DEAE）亲水性树脂，DNA磷酸基带负电荷，因此DNA可以结合到纯化柱上。我们在进行对比实验时，使用酚/氯仿抽提法和DNA纯化柱对动物组织线粒体DNA分别进行纯化，DNA浓度检测表明两种方法获得的DNA浓度差别很大，但是qPCR检测结果表明，两种方法获得的DNA中线粒体DNA的浓度无统计学上的差异。这个实验表明，将组织研磨匀浆并进行37℃/10min处理后，通过DNA凝胶回收试剂盒中的BufferG、WS和WG以及该公司质粒回收试剂盒中的DNA结合柱，可实现快速高效地获得动物动物组织线粒体DNA，全过程仅需35min，加上PCR80min，动物肉源性鉴定在约2h内完成。因此，将动物组织前处理的样品使用DNA纯化柱进行纯化，并去除大部分核DNA，一方面可以缩短DNA纯化的时间，另一方面，也可以避免使用具有强烈腐蚀性和致癌性的化学试剂——苯酚和氯仿，减少了此类废液的产生。具体实施方式我们前期对牛、羊肉鉴定进行了实验，此方法主要由两部分构成：①DNA纯化（需要4-5h），②PCR（DNA聚合酶链式反应）或qPCR（实时荧光定量PCR或称real-timePCR），利用自行设计的识别线粒体DNA片段的引物需80min。简而言之，由于DNA纯化需要长，使该鉴定方法的效率大打折扣。鉴于此，团队尝试了多种缩短纯化动物DNA的方法，并以传统DNA纯化方法为对照，对不同方法纯化的DNA的质量通过qPCR进行了分析比较。一、酚/氯仿纯化DNA方法该方法是实验室最常用的动物组织DNA的纯化方法，具体步骤如下：①在50mg动物组织中加入1mL裂解液（150mMNaCl，10mMpH8.0的Tris-HCl，10mMEDTA，0.1%SDS，20μg/mL蛋白酶K，10μg/mLRNaseA）进行研磨和匀浆，然后进行55℃/3h或37℃过夜处理。②16000g常温离心3min，取上清，加入等体积的Tris-饱和酚；③取上层水相，加入等体积1:1的酚氯仿混合液，混匀后16000g常温离心3min；④取上层水相，加入等体积的氯仿，混匀后16000g常温离心3min；⑤取上层水相，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃16000g离心20min；⑥去上清，在白色沉淀（DNA）中加入1mL预冷的70%乙醇，4℃16000g离心5min；⑦重复步骤⑥；⑧去上清，并尽可能将DNA沉淀周围的70%乙醇吸除；⑨将离心管置于50℃干式恒温器中，待白色DNA周围开始变透明时加入120μL纯水使DNA溶解，即获得动物组织的全部DNA，包括细胞核DNA和线粒体DNA。此法的优点在于省略了纯化线粒体的过程，大大缩短和简化了获得DNA的时间；不足在于需要非常熟练的人员进行操作，尽管并不影响肉源性的鉴定，但很容易引入基因组的DNA污染，损耗较大。如前所述，我们确立的动物源性的鉴定方法是识别线粒体DNA，而不是核DNA。而线粒体位于细胞质中，线本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.动物线粒体DNA的纯化方法，其特征在于：将待检测动物组织中加入裂解液，常温下研磨匀浆后离心，取上清液加入到DNA结合柱进行纯化，所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇亲水性树脂，裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化，纯化完毕的DNA结合柱中加入灭菌水，静置并常温离心，即可得到待检测动物的线粒体DNA；所述裂解液中蛋白酶K和RNase A的浓度分别为20μg/mL、10μg/mL，裂解温度为37℃，裂解时间为5min‑3h。

【技术特征摘要】
1.动物线粒体DNA的纯化方法，其特征在于：将待检测动物组织中加入裂解液，常温下研磨匀浆后离心，取上清液加入到DNA结合柱进行纯化，所述DNA结合柱表面偶联有带正电荷的二乙胺乙醇亲水性树脂，裂解处理后的浆液中的DNA结合到DNA结合柱上并完成纯化，纯化完毕的DNA结合柱中加入灭菌水，静置并常温离心，即可得到待检测动物的线粒体DNA；所述裂解液中蛋白酶K和RNaseA的浓度分别为20μg/mL、10μg/mL，裂解温度为37℃，裂解时间为5min-3h。2.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法，其特征在于：所述裂解液的处理时间为5-20min。3.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法，其特征在于：所述DNA结合柱的结合时长为1-40min。4.如权利要求1所述的动物线粒体DNA的纯化方法，其特征在于，所述裂解液的构成为：150mMNaCl；10mMTris-HCl，pH8.0；10mMEDTA；0.1%SDS；20μg/mL蛋白酶K；10μg/mLRNaseA。5.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仙玉，贾宇坤，张先福，马敬华，施伟斌，刘建勋，
申请(专利权)人：浙江农林大学，杭州野生动物世界有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33