一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用技术

本发明专利技术涉及一种异肽键扫描方法及其在蛋白质工程中应用，所述方法利用微生物为宿主，利用SpyTag与SpyCatcher系统可自催化形成异肽键的特性，将SpyTag或SpyCatcher随机替换某目标蛋白质肽链的任意氨基酸或插入某目标蛋白质肽链任意位置所得肽链的编码序列，置于合适的启动子及终止子，构建表达盒，在宿主控制下，实现转录及翻译，得到在多肽链不同氨基酸间自发形成了异肽键的目标蛋白质产物的集合。配合适当的筛选方法，可获得不同的改性蛋白质。本发明专利技术针对重组蛋白改性而开发，本发明专利技术提供了一蛋白质快速人工进化的方法。

A protein engineering method based on ISO peptide bond scanning and its application in protein engineering

The present invention relates to an allopeptide bond scanning method and its application in protein engineering. The method utilizes microorganisms as hosts, and takes advantage of SpyTag and SpyCatcher system to autocatalyze the formation of allopeptide bonds. SpyTag or SpyCatcher are randomly substituted for any amino acid of a target protein peptide chain or inserted into a target protein peptide chain. The coding sequence of the peptide chain was placed in the appropriate promoter and terminator, and the expression cassette was constructed. Under the control of the host, the transcription and translation were realized. The set of target protein products spontaneously formed heteropeptide bonds among different amino acids in the polypeptide chain were obtained. With different screening methods, different modified proteins can be obtained. The invention is developed for modification of recombinant protein, and provides a method for rapid artificial evolution of protein.

【技术实现步骤摘要】
一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用
本专利技术属蛋白质工程领域，涉及异肽键的形成，尤其是一种涉及SpyTag-SpyCatcher系统介导的分子自催化形成异肽键，特别是一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用。
技术介绍
一般地，蛋白质工程着力解决如下两个问题：1、蛋白质热力学稳定性问题。2、蛋白质功能动力学高效问题。目前，蛋白质工程技术存在以下两方面存在着改善空间：1、构效关系研究限制，定点突变蛋白质改性的效率不高核苷酸为基础的定向进化，因密码子简并性造成无意义的分子多样性，增加筛选过程难度；因个别氨基酸的变化对整体蛋白质结构与功能影响有限，更不可预知的是，在肽链氨基酸序列限定后，其有意义的生物多样性饱和的事实便已经决定了的能否通过这样的进化获得期望的工程蛋白质；2、多肽或蛋白质的定点化学修饰，存在生产成本高及产品质量均一性不好控制等问题。本专利技术公开一种新的蛋白质工程方法，在一定程度上可以突破上述生物多样性饱和特性的限制，而且因降低了负突变数量，其进化速度有了显著的提高，而且其产物均可通过基因预编程实现，没有后续的化学修饰。在玉米黄质裂解酶改性中显示出了本专利技术易于实施、进化速度快、效果明显等优点。随着生物学发展，越来越多蛋白质生理生化功能得到阐明，并进入酶制剂或医药蛋白开发成为生物产业的重要分支领域，其地位逐渐受到重视，尤其生物制药、生物能源、生物资源转化等领域展现出了令人鼓舞的前景。目前，工业酶制剂主要集中在底物为糖类、蛋白质、果胶、脂肪酸等少数品种，与已发现的酶类相比几乎处于起步阶段，这一方面反映了市场的需求状况，更深层次的原因在于其自身催化特性与工艺需求的差距。为增加酶催化的工艺适用性，通常是对酶制剂参与工艺过程之前进行预处理刺激或进行包埋等处理，如对脂酶的有机试剂预处理及包埋，延长了使用寿命，提高了其生物柴油生产中的催化效率，但这些使用前的操作无疑既费时又增加生产成本。新酶的分离、筛选成为一个新的选择，但即使不断有新的耐受性较好的酶被发现，其催化动力学方面也并不总是很理想，导致其催化效率难以维持在较高的水平。实验室定向进化技术的出现，使酶工程发展进入新阶段。一般的做法伴随着酶蛋白编码核酸序列中核苷酸的随机突变，之后，进入期望克隆筛选程序。这一过程模拟自然进化进程，理论上可以获得可能的催化特性。但这一过程也存在着显而易见的限制：首先，需要保证产生足够的生物多样性，这要求蛋白质(核酸)分子具有足够的长度；其次，因绝大多数为负突变，筛选工作依赖于高通量工作流程的建立；最后，因密码子的简并性及单个氨基酸突变在酶蛋白中影响力普遍较小等因素，导致核苷酸随机突变获得良好的酶蛋白的几率进一步降低。目前已经发现几种异肽键形成途径，分别是：泛素化途径(ubiquitylation),类泛素化(SUMO)，转谷氨酰胺化途径(transglutamination),分选酶途径(sortasemediatedreaction)及肽链链接酶途径(SpyLigasesystem)。其中，肽链链接酶途径最为灵活，所涉及的标签不受限于在肽链内的位置，已经应用于蛋白质工程，但仅限于定点修饰。尤其是将SpyTag与SpyCatcher分别置于多肽链的两端(C端及N端)，获得了高耐热性的改性蛋白质。因而与本专利技术所述不同。肽扫描(peptidescanning)称谓源于早期的肽链内氨基酸全饱和替换技术，即，从肽链的氨基端到羧基端单个氨基酸替换，如丙氨酸扫描(Alaninescanning)。之后，逐渐发展出更多这种类似技术，直至发展到肽链内部两个氨基酸间进行的酰胺扫描，肽扫描常用于基础研究，用来探索组成肽链的各氨基酸作用。本专利技术就是综合分析了SpyTag-SpyCatcher系统及认识肽扫描本质的基础上，经过理性思维及实验验证获得的一种新的蛋白质工程方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有策略的不足之处，提供一种蛋白质快速进化的方法，该方法对传统蛋白质工程起到了一个手段补充的作用，同时，因可以较大的改变蛋白质结构，进而深刻影响构效关系，更容易获得传统方法不易获得的某种性状的蛋白质或多肽。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法，其特征在于：所述方法依赖于某宿主内，分子内异肽键的形成，且这种异肽键的形成具有位置的任意，可应用于蛋白质工程领域，为蛋白质快速进化改性提供新的策略。而且，具体步骤如下：(1)首先用SpyCatcher(氨基酸序列AS1)或SpyTag(氨基酸序列AS2)定点替换某目标蛋白内部的氨基酸或寡肽段，或插入某目标蛋白氨基酸残基下游。避免编码拼接时造成移码突变及翻译终止突变；(2)将SpyTag或SpyCatcher随机替换上述已经载有SpyCatcher或SpyTag的某目标蛋白内部氨基酸或寡肽段，或插入目标蛋白肽链上任意氨基酸编码的位置，勿造成移码突变及翻译终止突变。最后，得到一可自发形成分子内异肽键的蛋白质文库；(3)将上述带有SpyCatcher的SpyTag随机替换或插入文库，在合适的宿主内表达；(4)通过文库筛选，获得蛋白质改性的工程蛋白。而且，分子内异肽键的形成不包括SpyTag与SpyCatcher同时位于肽链两端的情况。而且，高醇耐受性CCD2肽链内存在着异肽键，且其氨基酸序列与AS4所示序列同源性大于70％。如上所述的基于异肽键扫描的蛋白质工程方法在蛋白质工程中的应用。本专利技术取得的创新及优点：1、发展了肽扫描技术。与以往的肽扫描技术最大不同之处在于，通过结合SpyTag-SpyCatcher系统，在一条肽链内引入上述两个标签，进而使两标签间形成异肽键；2、弥补传统的蛋白质工程多依赖于单核苷酸随机突变的定向进化无意义文库及进化幅度小等缺点，本专利技术利用异肽键扫描，可以更显著的改变多肽链或蛋白质的结构，进而更深刻的影响蛋白质性质，有利于蛋白质构象的快速突变，为筛选提供了变异幅度更大的群体多样性，利于蛋白质性状的进化。3、本方法基于SpyTag-SpyCatcher系统，配合DNA合成技术、异源表达技术，整个进化过程可基因编码。4、SpyTag-SpyCatcher系统分离于细菌，但已成功应用于包括酵母脯乳动物细胞等多种微生物、细胞中，因此，本专利技术实用性强，适用性广。5、本方法利用微生物为宿主，利用SpyTag与SpyCatcher系统可自催化形成异肽键的特性，将SpyTag或SpyCatcher随机替换某目标蛋白质肽链的任意氨基酸或插入某目标蛋白质肽链任意位置所得肽链的编码序列，置于合适的启动子及终止子，构建表达盒，在宿主控制下，实现转录及翻译，得到在多肽链不同氨基酸间自发形成了异肽键的目标蛋白质产物的集合。配合适当的筛选方法，可获得不同的改性蛋白质。本专利技术针对重组蛋白改性而开发，本专利技术提供了一蛋白质快速人工进化的方法。附图说明图1为本专利技术中展示于EBY100细胞表面的不同环化CCD2在醇溶液中催化玉米黄质转化实验图；其中，各组数据为五次试验平均值。CK1，第一对照，为展示于EBY100细胞表面的野生型CCD2；CK2，第二对照，为含有pYD1空载体的EBY100细胞。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法，其特征在于：所述方法依赖于某宿主内，分子内异肽键的形成，且这种异肽键的形成具有位置的任意，可应用于蛋白质工程领域，为蛋白质快速进化改性提供新的策略。

【技术特征摘要】
1.一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法，其特征在于：所述方法依赖于某宿主内，分子内异肽键的形成，且这种异肽键的形成具有位置的任意，可应用于蛋白质工程领域，为蛋白质快速进化改性提供新的策略。2.根据权利要求1所述的基于异肽键扫描的蛋白质工程方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)首先用SpyCatcher即氨基酸序列AS1或SpyTag即氨基酸序列AS2定点替换某目标蛋白内部的氨基酸或寡肽段，或插入某目标蛋白氨基酸残基下游；避免编码拼接时造成移码突变及翻译终止突变；(2)将SpyTag或SpyCatcher随机替换上述已经载有SpyCatcher或SpyTag的某目标蛋白内部氨基酸或寡肽段，或插入目标蛋白肽链上任意氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳，王海勇，孙雅旭，梁鸿真，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37