植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用。本发明专利技术克服目前技术困难，筛选到一种新的高效吸附双链RNA(dsRNA)的纤维素粉—SIGMA公司C6288纤维素粉，并使用开发的塑料中心过滤柱对纤维素粉进行固定并形成dsRNA过滤纯化柱。该方法简化了实验操作步骤、降低实验难度、缩短实验时间、减少了病毒dsRNA在提取过程中损失和污染，且纯化获得的病毒dsRNA可以用于病毒基因组的测序和群体结构及变异进化分析、更优检测引物的设计和更优分子检测方法的建立，从而为dsRNA病毒病的致病机制的阐明和准确检测提供技术手段。

【技术实现步骤摘要】
植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用。
技术介绍
植物病毒中大部分病毒是RNA病毒，尤其是双链RNA(dsRNA)病毒。高浓度、高纯度提纯dsRNA病毒的双链RNA基因组，是对dsRNA病毒遗传、变异进行分析的基础。由于病毒粒子提纯困难，且在寄主体内含量低、易降解等原因，使从提纯病毒粒子中提取病毒基因组dsRNA的方法效率低下。例如，属于呼肠孤病毒科斐济病毒属的水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)可侵染水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、马唐、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻的黑条矮缩病和玉米的矮缩病。该病毒粒子呈直径70～75nm的球形，含10条dsRNA病毒基因组。但该病毒粒子含量低且不稳定，目前无法从植物组织中分离高质量的病毒粒子用于双链RNA的提取。而dsRNA在热条件下稳定，对RNA酶的降解抗性强，所以直接从植物叶片组织中纯化双链RNA是一个较好的替代方案。目前dsRNA提纯方法主要有以下几种：1)是用TRIzo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，该纯化柱由离心管、双层Miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层Miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层Miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。

【技术特征摘要】
1.一种用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，该纯化柱由离心管、双层Miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层Miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层Miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。2.如权利要求1所述的用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，所述的离心管采用外直径1.0cm、内直径0.9cm、高度4.2cm的2mL塑料离心管；所述双层Miracloth膜的直径为0.75cm；所述滤片直径0.75cm，厚度0.1cm，孔径20μm；所述中心过滤柱采用外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm的塑料中心过滤柱。3.一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法，其特征在于其采用权利要求1所述的dsRNA过滤纯化柱实现。4.如权利要求3所述的植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法，其特征在于包括如下步骤：1)取80mg感染双链RNA病毒的植物叶片组织，在研钵中加液氮后研磨成泛白的粉末状，快速转移至RNasefree的2.0mL离心管中；2)上述离心管中加入500μLpH8.0的含1％SDS、0.1％β-mercaptoethanol、2mmol/LEDTA和200mmol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl核酸提取液和10mg聚乙烯吡咯烷酮，震荡涡旋1min；3)加入500μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，涡旋1min，20000g离心5min，若上清浑浊，重复此步骤；4)取离心后的上清移至新1.5mLeppendorf离心管管中，加入无水乙醇使其终浓度为16.6％，上下颠倒混匀，20000g离心3min；5)在所述的dsRNA过滤纯化柱的中心过滤柱底部放置好双层Miracloth膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，何梦竹，张天则，傅帅，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33