植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用。本发明专利技术克服目前技术困难，筛选到一种新的高效吸附双链RNA(dsRNA)的纤维素粉—SIGMA公司C6288纤维素粉，并使用开发的塑料中心过滤柱对纤维素粉进行固定并形成dsRNA过滤纯化柱。该方法简化了实验操作步骤、降低实验难度、缩短实验时间、减少了病毒dsRNA在提取过程中损失和污染，且纯化获得的病毒dsRNA可以用于病毒基因组的测序和群体结构及变异进化分析、更优检测引物的设计和更优分子检测方法的建立，从而为dsRNA病毒病的致病机制的阐明和准确检测提供技术手段。

【技术实现步骤摘要】
植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用。
技术介绍
植物病毒中大部分病毒是RNA病毒，尤其是双链RNA(dsRNA)病毒。高浓度、高纯度提纯dsRNA病毒的双链RNA基因组，是对dsRNA病毒遗传、变异进行分析的基础。由于病毒粒子提纯困难，且在寄主体内含量低、易降解等原因，使从提纯病毒粒子中提取病毒基因组dsRNA的方法效率低下。例如，属于呼肠孤病毒科斐济病毒属的水稻黑条矮缩病毒(Riceblackstreakeddwarfvirus，RBSDV)可侵染水稻、大麦、小麦、玉米、高粱、马唐、白草和稗草等多种禾本科作物和杂草，引起水稻的黑条矮缩病和玉米的矮缩病。该病毒粒子呈直径70～75nm的球形，含10条dsRNA病毒基因组。但该病毒粒子含量低且不稳定，目前无法从植物组织中分离高质量的病毒粒子用于双链RNA的提取。而dsRNA在热条件下稳定，对RNA酶的降解抗性强，所以直接从植物叶片组织中纯化双链RNA是一个较好的替代方案。目前dsRNA提纯方法主要有以下几种：1)是用TRIzol试剂提纯动植物组织中的总RNA，然后用DNA酶和RNA酶消化总RNA，除去DNA和单链RNA而获得dsRNA。但这种方法提取dsRNA的质量和效率非常低，往往达不到下游基因组分析的要求；2)提取的总RNA用氯化锂或氯化铯进行密度梯度离心的方法提取纯化dsRNA；但这种方法由于提取dsRNA的数量有限、操作繁琐、费用昂贵而限制其推广应用3)用纤维素粉吸附dsRNA的纯化方法。1966年Franklin等第一次用纤维素粉和一定浓度的乙醇将噬菌体R17的核糖体RNA中分离出dsRNA形式的复制中间体。作者将细胞破碎后除去蛋白质等杂质，留下总核酸。然后加入将总核酸吸附在纤维素粉上，用含有15％乙醇的STE溶液洗去DNA、核糖体RNA以及单链RNA，再用不含乙醇的STE洗脱可以得到dsRNA形式的复制中间体。Morris和Dodds于1979年用酚和氯仿变性蛋白提取植物和真菌总核酸，然后用纤维素粉吸附成功从感染病毒的植物和真菌中提取出了病毒基因组dsRNA。然而，这些用纤维素粉纯化dsRNA的方法因目前该类型的纤维素粉(CF-11)停产而无法再进行，且该纯化方法使用纤维素粉提取dsRNA的过程发生在离心管内，需要反复悬浮、离心纤维素粉后吸除上清的方式去除纤维素粉上吸附的ssRNA和DNA，得到相对纯净的dsRNA。这个过程耗时较长、操作繁琐、且在反复悬浮吹打纤维素粉的过程中会损失较多dsRNA，故其纯化dsRNA的效率很低。本专利技术克服目前技术困难，筛选到一种新的高效吸附dsRNA纤维素粉--C6288纤维素粉，并使用开发的制备管对纤维素粉进行固定，通过将纤维素粉固定于制备管中制作为便捷的成品纯化柱，再将制备柱套入2mL离心管可以实现吸附dsRNA以及之后清洗纯化步骤只要通过离心的方式就可以完成，从而大大简化了实验操作步骤、降低实验难度、缩短实验时间、减少了dsRNA在提取过程中的损耗。通过使用本方法针对水稻叶片中RBSDV基因组dsRNA进行了提取纯化，采用250mgC6288纤维素粉制备的纯化柱，提取80mg感染RBSDV的水稻样品中的dsRNA效果最佳。该提纯方法提取到高质量的10条RBSDV病毒基因dsRNA，以提纯的RBSDV基因组dsRNA为模板用第一至第三代核酸测序技术进行基因组测序，根据测序的数据结合生物信息学技术，分析了该病毒的基因组准种结构、遗传变异，并利用基因组测序数据进行RT-PCR和qRT-PCR引物设计和方法建立，从而为该病毒病的致病机制的阐明和准确检测提供技术手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法及其应用。本专利技术具体采用的技术方案如下：用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，该纯化柱由离心管、双层Miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层Miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层Miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。上述dsRNA过滤纯化柱中，各部件的具体参数可采用如下：离心管采用外直径1.0cm、内直径0.9cm、高度4.2cm的2mL塑料离心管；所述双层Miracloth膜的直径为0.75cm；所述滤片直径0.75cm，厚度0.1cm，孔径20μm；所述中心过滤柱采用外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm的塑料中心过滤柱。一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法，其采用上述特制的dsRNA过滤纯化柱实现。该方法的具体实现步骤依次如下：1)取80mg感染双链RNA病毒的植物叶片组织，在研钵中加液氮后研磨成泛白的粉末状，快速转移至RNasefree的2.0mL离心管中；2)上述离心管中加入500μLpH8.0的含1％SDS(十二烷基硫酸钠，Sodiumdodecylsulfate)、0.1％β-mercaptoethanol、2mmol/LEDTA和200mmol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl核酸提取液和10mg聚乙烯吡咯烷酮，震荡涡旋1min；3)加入500μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，涡旋1min，20000g离心5min，若上清浑浊，重复此步骤；4)取离心后的上清移至新1.5mLeppendorf离心管管中，加入无水乙醇使其终浓度为16.6％，上下颠倒混匀，20000g离心3min；5)在所述的dsRNA过滤纯化柱的中心过滤柱底部放置好双层Miracloth膜和滤片后，加入250mgSIGMA公司的C6288纤维素粉，然后将装有纤维素粉的中心过滤柱套入过滤纯化柱的2mL的离心管中，将步骤4)中的上清移至有纤维素粉的中心过滤纯化柱中，将带有中心过滤柱的离心管整体于10000g离心5sec；6)加入400μlpH8.0含16％无水乙醇、1mMEDTA和100mMNaCl的10mMTris-HCl核酸清洗液，10000g离心5sec，弃去2.0mL离心管中的滤液，重复该洗涤步骤三次；然后10000g离心5sec彻底除去中心过滤纯化柱中的核酸清洗液；7)将有纤维素粉的中心过滤柱置于新的1.5mLeppendorf离心管中，加入400μLpH8.0含1mMEDTA和100mMNaCl的10mMTris-HCl核酸洗脱液，10000g离心5sec，收集洗脱液，重复此步三次；8)在含有dsRNA的核酸洗脱液中加入1/10倍体积pH5.2的3mol/L乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇；9)-20℃静置10min后，20000g离心5min沉淀dsRNA；10)去上清，加入预冷的1mL75％乙醇洗涤沉淀，20000g离心5min，去上清，重复此步骤1次；11)去上清，室温静置干燥后加入30μlpH8.0含2mmol/LEDTA和200mmol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl核酸溶解液溶解dsRNA，得到dsRNA提取液。12)取1μLdsRNA提取液用Nanodrop检测浓度，取15μL进行0.8％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，该纯化柱由离心管、双层Miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层Miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层Miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。

【技术特征摘要】
1.一种用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，该纯化柱由离心管、双层Miracloth膜、滤片以及带盖子的中心过滤柱组成，双层Miracloth膜置于所述中心过滤柱底部，所述滤片置于双层Miracloth膜上；所述中心过滤柱嵌套式置于离心管内。2.如权利要求1所述的用于植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的dsRNA过滤纯化柱，其特征在于，所述的离心管采用外直径1.0cm、内直径0.9cm、高度4.2cm的2mL塑料离心管；所述双层Miracloth膜的直径为0.75cm；所述滤片直径0.75cm，厚度0.1cm，孔径20μm；所述中心过滤柱采用外直径0.8cm、内直径0.7cm、高度3.1cm的塑料中心过滤柱。3.一种植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法，其特征在于其采用权利要求1所述的dsRNA过滤纯化柱实现。4.如权利要求3所述的植物组织中高效提纯病毒双链RNA基因组的方法，其特征在于包括如下步骤：1)取80mg感染双链RNA病毒的植物叶片组织，在研钵中加液氮后研磨成泛白的粉末状，快速转移至RNasefree的2.0mL离心管中；2)上述离心管中加入500μLpH8.0的含1％SDS、0.1％β-mercaptoethanol、2mmol/LEDTA和200mmol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl核酸提取液和10mg聚乙烯吡咯烷酮，震荡涡旋1min；3)加入500μL体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇，涡旋1min，20000g离心5min，若上清浑浊，重复此步骤；4)取离心后的上清移至新1.5mLeppendorf离心管管中，加入无水乙醇使其终浓度为16.6％，上下颠倒混匀，20000g离心3min；5)在所述的dsRNA过滤纯化柱的中心过滤柱底部放置好双层Miracloth膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，何梦竹，张天则，傅帅，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33