基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。本发明专利技术以减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。

Recombinant cancer attenuated single increased Lester mesothelin high therapeutic expression cancer therapeutic vaccine

The present invention relates to a highly expressed cancer therapeutic vaccine based on recombinant attenuated Listeria monocytogenes. The present invention takes Listeria monocytogenes (hereinafter referred to as Lm) as a carrier, utilizes the unique ability of Listeria monocytogenes to grow in phagocytes of host cells, is a natural T cell immune activating adjuvant, effectively improves the specific immune response in tumor microenvironment, and breaks the immune tolerance of the body. By, thus clearing the body of persistent virus infection, to clear the focus, to curb the development of tumor good therapeutic effect. Its advantage is to make up for the disadvantage of low immunogenicity of nucleic acid and protein polypeptide vaccines. The attenuated Listeria spp. retains the ability of the original strain to grow in the cell, completes the characteristics of antigen presentation and has higher safety.

【技术实现步骤摘要】
基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗
本专利技术属于生物
，涉及一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。
技术介绍
研究发现间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其表达通常局限于间皮(腹膜，心包，和胸膜)，同时发现在间皮瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌中，间皮素蛋白显著高表达。(MesothelinANewTargetforImmunotherapy，RaffitHassan，TapanBera，andIraPastandoi:10.1158/1078-0432.CCR-03-0801ClinCancerResJune15,200410；3937)这种特征使得间皮素成为运用重组李斯特菌治疗肿瘤的工具抗原。间皮瘤是一种主要出现在胸腔或腹腔内壁上的肿瘤，与工作环境中接触石棉纤维有关。在美国每年被诊断的患者是2500～3000个。目前手术和放疗效果都不理想，化疗效果较好。胰腺癌是出现在胰脏且非常致命的癌症，患者5年内的存活率小于5％，根据世界卫生组织2014年数据，2012年胰腺癌在全球造成33万人死亡，是癌症患者的7种最常见的致死因素。且胰腺癌初期没有明显症状，发现症状后通常是疾病的晚期，绝大多数病人在发现时已经是局部侵袭性疾病或已发生转移，这时候在通过手术治疗只能是缓解症状而无法治愈患者。目前通过每周静脉给药的吉西他滨(美国FDA在1997年批准上市)只能改善患者生活质量，稍微延长患者生存时间。使用FOLFIRINOX化疗方案(5-氟尿嘧啶，亚叶酸钙，伊立替康，和奥沙利铂)则副反应明显，只能用于非常有限的患者。卵巢癌是指出现在女性卵巢的癌症，2012年全球有23万患者并且造成15万人死亡。是7种常见癌症，并且是造成女性癌症患者死亡的常见原因。目前手术和化疗结合是治疗卵巢癌的常见方法。肺癌是一种发生在肺组织内，细胞失去控制生长的非常致命的疾病。肺癌如不及时接受治疗，很容易转移到附近组织和机体其他器官。肺癌是癌症患者最主要的死亡原因，2012年造成全球156万人口死亡，患者5年内的存活率小于17％。目前手术，放疗和化疗协同治疗是对抗肺癌的常见方法。治疗性疫苗与传统的治疗手段，如外科手术，放化疗相比具有伤害小、毒性低的特点。目前治疗性疫苗的存在形式主要有三种：蛋白质多肽疫苗、病毒(细菌)疫苗以及核酸疫苗。其成功的关键是引起足够的免疫应答，但是目前的核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低，缺陷明显。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌。优选的，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简称Lm)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。优选的，所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。进一步优选的，具体步骤如下：(1)合成间皮素基因片段；(2)构建打靶质粒；(3)制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择单增李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI3900-ThermoFisherScientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，如SEQIDNO.1所示。更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQIDNO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-Meso，其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQIDNO.3所示。更进一步优选的，重组质粒pCW180的制备方法如下：(2-A)将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lmmpl基因(GenbankID：DQ054595.1)插入质粒pCW154(专利CN103074361B)的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQIDNO.4所示；(2-B)将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的LmorfBAldh基因(GenbankID：M82881.1)插入上述步骤(2-A)得到的第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQIDNO.5所示；(2-C)用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-B)得到的第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：将LmΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。更进一步优选的，LmΔactAplcB-lacZ的制备方法如下：(3-A)将上、下游分别带NotI酶切位点的lacZ基因片段(专利CN103074361B)插入第二中间重组质粒pCW170的NotI酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒pCW190的基因序列为序列表中SEQIDNO.6所示；(3-B)将步骤(3-A)所得打靶质粒pCW190电转化Lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：接种LmΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时；将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5分钟，弃上清；以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其特征在于，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌。

【技术特征摘要】
1.基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其特征在于，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，具体步骤如下：(1)合成间皮素基因片段；(2)构建打靶质粒；(3)制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素蛋白氨基酸序列，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得，如SEQIDNO.1所示。6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203HindⅢ和...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈海浅，
申请(专利权)人：南京颂悦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32