本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体公开了一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法，所述单甘酯脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述脂肪酶晶体一个晶格含有6个蛋白分子，所述晶体每个单分子含有9个α螺旋结构和9个β折叠片。本发明专利技术提供的单甘酯脂肪酶的晶体结构信息可以用以更高效地获得提高底物选择性、热稳定性及催化效率的酶变异体，满足工业化应用的要求。
Marine source monoglyceride lipase and crystal structure and preparation method thereof
The invention belongs to the field of enzyme engineering technology, and discloses a marine monoglyceride lipase and its crystal structure and preparation method. The amino acid sequence of the monoglyceride lipase is shown as SEQ ID NO.1. One lattice of the lipase crystal contains six protein molecules, and each single molecule of the lipase crystal contains nine alpha helical structures and nine beta folding sheets. The crystal structure information of the monoglyceride lipase provided by the invention can be used to obtain more efficient enzyme variants to improve substrate selectivity, thermal stability and catalytic efficiency, and meet the requirements of industrial application.
【技术实现步骤摘要】
一种海洋来源单甘酯脂肪酶及其晶体结构和制备方法
本专利技术涉及一种单甘酯脂肪酶晶体结构及其解析方法，属于酶工程
技术介绍
研究表明，在神经系统中大麻素系统能够决定生物体的神经元的存活与死亡，体内和体外实验都已经证实，当生命体神经元受到损伤，如兴奋性中毒、外伤性脑损伤、脑缺血时，大麻素能够对机体起到及时保护作用。大麻素系统能够通过减少细胞钙内流，抑制谷氨酸能神经递质、抑制机体自由基的形成、调节神经细胞发育等方式保护机体。大麻素系统对于机体神经元细胞具有双重作用。动物实验发现，长期给与大麻素药物将导致持久的认知功能缺陷。长期被给予大麻素的模型，其海马体的形态学发生了改变，包括神经元死亡、突触密度和锥体细胞树突长度的都明显减少。这表明，长期给予大麻素将对机体产生神经毒性作用。研究表明，内源性大麻素的酶降解是由两个特殊的酶系统完成的：脂肪酰胺水解酶和单甘酯脂肪酶。尽管脂肪酰胺水解酶能够使2-花生四烯酸甘油失活，但是在降解内源性大麻素的过程中单甘酯脂肪酶发挥主要作用，单甘酯脂肪酶是一种属于丝氨酸水解酶家族的脂肪酶，它主要分布于特定脑神经元的神经末梢中，对生命体的内源性大麻素系统起到调控作用。近几年来随着流行病学的深入研究，肥胖症与肿瘤之间的关系也被进一步确定，研究表明，生命体脂质的异常代谢会导致肿瘤易感性增强。甘油单酯脂肪酶，主要作用于脂肪的分解代谢，将单酰基甘油进行水解并产生游离脂肪酸。研究表明单甘酯脂肪酶在肿瘤的进展中起到重要调节作用，同时如果单甘酯脂肪酶被敲低后，生命体肿瘤细胞的生长明显被抑制，这表明人体内的单甘酯脂肪酶可以成为一个新的治疗肿瘤的靶点。单甘酯是油脂的衍生物，是甘油中一个羟基与脂肪酸结合的产物，是一种高效的表面活性剂。单甘酯的合成主要有量汇总方法：化学合成法和酶合成法。其中，化学法生产单甘酯主要有酯交换和酯化法两种方法，其原料主要是甘油、脂肪酸。其中酯交换又称为油脂甘油解法、醇解。除了脂肪醇解、甘油脂肪酸酯化外，单甘酯的化学法生产还有缩水甘油法、环氧氯丙烷法、化学基团保护法等。酶法生产单甘酯目前只是出于实验室研究阶段，限制其工程应用的最大的阻碍是酶与底物的接触困难导致生产效率下降而生产成本大幅度提高。综上所述，单甘酯酶在医药科学领域以及食品加工领域具有重要的发展前景。脂肪酶的开发与应用依赖于酶本身的底物特异性，而脂肪酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的三维结构。蛋白质的三维结构对于了解其生物功能、设计药物以及蛋白质药物的基因工程等方面具有非常重要的作用。目前，X-射线单晶衍射方法是通过蛋白质单晶获得其三维结构的最重要的研究方法之一。对于X-射线单晶衍射方法，蛋白质单晶必须达到足够大的尺寸和完善程度。然而，由于溶液中蛋白质分子之间的相互作用位点较少，相互作用力比较弱，蛋白质晶体中往往含有很大比重的水，因此，内部结构比较规整的蛋白质晶体仍旧很难获得。获得高质量的蛋白质晶体仍旧是蛋白质结构解析的瓶颈问题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供的单甘酯脂肪酶是第一个来自海洋的单甘酯脂肪酶GMGL，对研究来自海洋的酶蛋白具有很高的参考价值。本专利技术还提供了上述单甘酯脂肪酶的晶体结构，及其晶体的制备方法。本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供的单甘酯脂肪酶GMGL的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，分子量为26.9kDa。所述脂肪酶晶体一个晶格由6个蛋白分子组成，分别为：chainA、chainB、chainC、chainD、chainE、chainF；所述晶体每个单分子含有9个α螺旋结构和9个β折叠片。其晶体外形为针叶状形貌，空间群为P1211；晶胞参数为α＝γ＝90.00°，β＝92.06°。所述的晶体中由丝氨酸S97、天冬氨酸D196、组氨酸H226构成其“催化三联体”；其盖子区域由赖氨酸K183-精氨酸R234组成；甲硫氨酸M97、丙氨酸A78构成其“氧负离子洞”区域，属于一种典型的丝氨酸水解酶家族类脂肪酶。本专利技术还提供了一种海洋来源单甘酯脂肪酶的晶体的制备方法，包括以下步骤：将海洋来源单甘酯脂肪酶的基因序列连接至pET-30a(+)质粒中，将表达载体转入宿主菌BL21(DE3)中表达、纯化获得纯蛋白；将纯蛋白浓缩为12mg/mL的蛋白水溶液，将蛋白溶液与池液混合，采取坐滴法对结晶条件进行高通量筛选；对结晶条件进行优化，得到了满足结构解析的晶体。所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH5.6～7.0和20％～30％w/v聚乙二醇单甲醚5000。所述池液含有0.2M硫酸铵、0.1M吗啉乙磺酸pH6.6和28％w/v聚乙二醇单甲醚5000。本专利技术也提供了一种解析脂肪酶晶体结构的方法，即：从母液中可以获得晶体，利用液态氮气流快速冷冻，在100K下利用X射线源获得的晶体数据，具体过程如下：首先使用的尼龙晶体环(如HamptonResearch公司的)，从晶体浸泡液中获取适宜X射线衍射的晶体，并迅速使用冷却系统(如OxfordCryosystem公司的)产生的低温氮气流中冷冻至零下150-180℃；使X射线通过晶体，利用旋进法收集X射线衍射数据。收集到晶体的X射线衍射数据后，按照下述步骤进行相应的数据处理：首先使用HKL2000等软件对上一步骤中收集得到的衍射数据进行处理，获得完整的数据文件；其次，使用CCP4程序包中的Phaser、Molrep等软件，利用分子置换(MR，MolecularReplacement)方法，以已知的单甘酯脂肪酶的结构为搜索模型，得到来自海洋的单甘酯脂肪酶GMGL的精细结构。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术提供了一种海洋微生物来源的单甘酯酶GMGL的三维结构信息，为该类酶的分子改造提供了酶蛋白结构信息基础，以更高效地获得提高底物选择性、热稳定性及催化效率的酶变异体，满足工业化应用的要求。附图说明图1为GMGL经过Ni柱纯化之后的SDS-PAGE电泳图；1：裂解液；2：裂解液上清；3：20mM咪唑洗脱液；4:500mM咪唑洗脱液。图2为GMGL经过分子筛纯化之后的SDS-PAGE电泳图。1：上样前样品；2-9：分子筛不同时段的出峰样品。图3为GMGL高通量筛选的针叶状晶体示意图。图4为GMGL优化后的针叶状晶体示意图。图5为GMGL晶体结构示意图。图6为GMGL单分子晶体示意图。具体实施方式本专利技术主要涉及GMGL的晶体结构及其解析方法。一方面，本专利技术在分子水平的基础上解析了GMGL的晶体结构。晶体结构及其衍生出的信息适用于设计和鉴定新底物，适用于设计具有高稳定性和底物特性的突变酶，适用于设计具有高催化活性的酶。本专利技术可用于诸如，改善单甘酯产量、提高酶活性、改变底物特异性、提高温度和pH稳定性、构建单甘酯脂肪酶突变体库、医药领域筛选抑制剂等方面。另一方面，本专利技术提供了解析单甘酯脂肪酶晶体结构的方法，通过该方法成功获得单甘酯脂肪酶GMGL的晶体结构。本专利技术公布的GMGL晶体结构信息可用于解释基于构效关系的脂肪酶催化机制。本专利技术可以用于设计和/或修改单甘酯脂肪酶以提高酶的催化活性，提高稳定性以及调节底物特异性。下面通过实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。实施例1单甘酯脂肪酶GMGL的表达与纯化人工合本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种海洋来源单甘酯脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种海洋来源单甘酯脂肪酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述单甘酯脂肪酶的晶体结构，其特征在于，所述脂肪酶晶体一个晶格含有6个蛋白分子；所述晶体每个单分子含有9个α螺旋结构和9个β折叠片。3.根据权利要求2所述的晶体结构，其特征在于，其晶体外形为针叶状形貌，空间群为P1211；其晶胞参数为：α＝γ＝90.00°，β＝92.06°。4.根据权利要求2或3所述的晶体结构，其特征在于，晶体中由丝氨酸S97、天冬氨酸D196、组氨酸H226构成其“催化三联体”；其盖子区域由赖氨酸K183-精氨酸R234组成；甲硫氨酸M97、丙氨酸A78构成其“氧负离子洞”区域。5.一种权利要求1所述海洋来...
【专利技术属性】
技术研发人员：蓝东明，袁红，王永华，唐薇，杨博，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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